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前神经病学。2017; 8: 281.
2017年6月30日在线发布。 数字对象标识：10.3389/fneur.2017.00281
预防性维修识别码：项目经理5492331
PMID：28713327

IL-2/抗IL-2复合物减轻创伤性脑损伤小鼠的炎症和血脑屏障破坏

高伟伟,1,† 费力,1,† 周紫薇,1,† Xin Xu（新旭）,1 吴银刚,1 帅周,1 尹东培,1 孙东东,1 熊建华,1 姜荣才,1和张建宁1,*
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

创伤性脑损伤（TBI）会导致过度炎症和血脑屏障的破坏，这两者部分由小胶质细胞的激活和炎症细胞因子的释放介导。以前的报道表明，调节性T细胞（Tregs）的给药可以抑制炎症并促进神经功能恢复，IL-2/抗IL-2复合物（IL-2C）可以增加Tregs的数量。因此，我们假设IL-2C介导的Tregs扩增对TBI小鼠有益。在本研究中，小鼠连续三天腹腔注射IL-2C。我们观察到，IL-2C剂量依赖性地增加Tregs，而不影响CD4、CD8或自然杀伤细胞的数量。IL-2C可促进神经功能恢复，减少脑水肿、组织丢失、中性粒细胞浸润和紧密连接蛋白降解。此外，该复合物还可以降低CD16/32、IL-1β或TNF-α的表达，升高CD206、精氨酸酶1或TGF-β的表达。这些结果表明，IL-2C可能是减轻TBI后过度炎症和维持血管稳定性的潜在治疗方法。

关键词：创伤性脑损伤、IL-2/抗IL-2、调节性T细胞、小胶质细胞、炎症、血脑屏障

引言

创伤性脑损伤（TBI）是世界范围内，尤其是年轻人死亡和严重残疾的主要原因之一。尽管许多干预措施在受伤后的不同时间点实施，但促进这些患者的长期康复仍然是一个重大挑战。最初的创伤后，炎症反应会加重大脑损伤，主要是通过白细胞浸润与小胶质细胞活化(1–4). 尽管这些细胞对碎片清除和组织重塑至关重要(5)其过度激活导致释放大量细胞毒性分子，最终损害神经元、细胞外基质和内皮细胞(6,7).

Tregs是调节炎症反应的关键内源性免疫调节细胞(8–10). 安在体外实验表明，Tregs抑制巨噬细胞的促炎作用，并促进巨噬细胞向抗炎表型分化(11). Liesz等人表明，卒中后增强Tregs可减少小胶质细胞的激活和神经毒性细胞因子的分泌(12,13). 此外，Li等人证明，静脉输注Tregs通过抑制中性粒细胞衍生基质金属肽酶9并减少随后血脑屏障的蛋白水解损伤而发挥神经保护作用(14). 然而，除了Yu等人的一份报告外，很少有研究检测Tregs在TBI中的作用。该报告指出，删除Tregs会加速TBI造成的损伤，过继转移对炎症反应具有抑制作用(15). 因此，增加TBI后Tregs水平可能是改善这些患者预后的潜在策略。据报道，IL-2/抗IL-2复合物（IL-2C）可在不同疾病中迅速增加Tregs，包括中风、肌无力或动脉粥样硬化，并通过抑制炎症和显著减轻这些疾病的进展来提供保护作用(12,16–19). 潜在机制是抗IL-2（JES6-1）在不影响IL-2受体α链（CD25）的情况下阻止IL-2与IL-2受体β链的相互作用(18). 然而，IL-2C对TBI的影响尚不清楚。因此，在本研究中，我们旨在探讨IL-2C治疗对TBI后恢复的作用。

材料和方法

动物和TBI模型

雄性C57BL/6小鼠（20–23 g） 从军事医学科学院实验动物实验室获得，单独存放在温度（22°C）和湿度控制（60%）的动物饲养室中，可免费获得食物和水。所有实验程序均获得中国小动物保护协会实验方案的批准。

在本研究中，共有105只雄性小鼠被纳入本研究，并分为以下三组(n个 = 35只/组）：I组，TBI小鼠，腹腔注射IL-2C；第II组，接受TBI并注射等体积PBS的小鼠；和III组，只接受假手术。分别对五只小鼠进行束流行走/前肢足缺损、流式细胞术、组织丢失、免疫组织化学、含水量、选择性标记物免疫印迹和免疫荧光检测。

TBI模型使用受控皮层冲击（CCI）装置（eCCI模型6.3；美国弗吉尼亚州里士满VCU）构建。简单地说，将麻醉小鼠置于立体定向框架内，在右侧顶骨上钻一个2.0毫米的洞，露出硬脑膜。然后，小鼠受到一次撞击，撞击速度为4.5 m/s，停留时间为150 ms导致顶叶结合皮层1.5毫米深的变形。假伤是在没有撞击的情况下进行的。

IL-2C给药

如前所述制备IL-2/抗IL-2复合物(20). 重组小鼠IL-2（rmIL-2，分类号：575406）和纯化抗IL-2（分类号：503704）购自BioLegend（SanDiego，CA92121）。TBI小鼠腹腔注射200 μl IL-2C或PBS，在2、24和48 TBI后h（图​（图1）。1). IL-2C与rmIL-2和抗IL-2混合如下：（1）IL-2C1，1 微克IL-2 + 5 μg抗IL-2；（2） 白细胞介素-2C2, 0.5 微克IL-2 + 2.5 μg抗IL-2；和（3）IL-2C三, 0.1 微克IL-2 + 0.5 μg抗IL-2。在注射复合物之前，将其在37°C下培养30 最小值。

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实验设计示意图。C57BL/6小鼠在第0天对右侧皮质进行了控制性皮质撞击。然后，小鼠接受200 2、24和48时腹腔注射μl IL-2C或PBS 创伤性脑损伤（TBI）后h。伤后取脑进行免疫组织化学/免疫荧光、流式细胞术、脑含水量和蛋白质分析。对假小鼠进行同样的试验，但不造成脑损伤。

脑单核细胞的分离

使用不连续Percoll梯度法从神经系统中分离出单核细胞(21). 五只小鼠经心灌注冷PBS后，收集损伤同侧大脑皮层（以下简称同侧皮层），并通过40µm细胞过滤器机械均质。细胞在50毫升试管中用冷PBS清洗，2000年离心 5转/分 最低温度为4°C。所得细胞颗粒在5分钟内再次悬浮 ml 30%Percoll（Sigma-Aldrich，分类号：P1644），在15 ml试管中与70%Percoll离心15 分钟。收集30%和70%Percoll界面之间的细胞单层并洗涤一次以进行进一步染色。

流式细胞术

来自脾脏和大脑的单核细胞表面标记有抗小鼠CD4 FITC（eBioscience，分类号：11-0042）、CD25 PE（eBioscience；分类号：12-0251）、NK1.1 PE（eBioscience，分类号为12-5941-82）、CD8 FITC（e Bioscision，分类号号：11-0081-81）和B220 APC（eBioccience：17-0452-81）。对于Tregs标记，使用Foxp3/转录因子染色缓冲液试剂盒（eBioscience，分类号：00-5523）进一步固定和渗透细胞，然后用抗鼠Foxp3 APC染色（eBioccience、分类号：17-5773）。将细胞洗涤并悬浮在流式细胞术染色缓冲液（eBioscience，Cat#:00-422-57）中。使用Accuri C6软件（BD Biosciences，San Jose，CA，USA）进行FACS分析。

组织损失

TBI后第3天，创伤性病变周围有大量血液和坏死组织，这将影响实验结果。因此，我们在TBI后第7天随机选择5只小鼠处死并经心灌注生理盐水和4%多聚甲醛。脱水和透明后，将大脑埋入石蜡中，切割成6个 µm截面。为了评估病变体积，我们准备了七个大脑切片，每0.5个切片 0.5至3.5毫米 用吉尔苏木精和伊红染色。这些图像是使用倒置荧光显微镜（日本奥林巴斯）捕获的，并使用ImageJ（美国马里兰州贝塞斯达NIH）进行数字化。我们通过从损伤对侧半球（以下简称对侧半球）减去损伤同侧半球（以下称同侧半球）的大小来计算每个截面的损伤面积。然后，将每个截面的病变面积和两个截面之间的距离积分，计算病变体积。计算同侧半球的组织损失占对侧半球体积的百分比。

免疫组织化学

脑切片脱蜡并复水后，在柠檬酸盐缓冲液（pH 6.0）中煮沸以回收抗原，并与3%过氧化氢（H2O（运行）2)对于20 min，然后在PBS中加入3%牛血清白蛋白60 min（阻止非特定绑定）。预处理后，将切片与兔抗鼠MPO抗体（稀释度1:100，Abcam，Cat#:ab9535）、兔抗鼠Iba-1抗体（稀释率1:500，Wako，Cat#:019-19741）和山羊抗精氨酸酶1（稀释度1:00，Santa Cruz Biotechnology，Cat#:sc-18355）孵育过夜。然后用生物素化抗兔免疫球蛋白G（稀释度1:400，载体）孵育2 使用亲和素-过氧化物酶结合溶液（ABC，1:1000；载体）识别结合抗体，并使用二氨基联苯胺进行可视化。阴性对照切片用相同的免疫印迹程序处理，但不含一级抗体。

免疫荧光

如前所述进行免疫荧光(22). 受伤后第3天，对五只小鼠进行安乐死，以制备冷冻脑切片。植入的大脑被切成6个 µm厚的部分，在4°C的丙酮中固定20 min，在3%BSA中孵育30 37°C时最小值。然后将切片与以下抗体孵育过夜：抗CLN5（1:100，Abcam，Cat#:ab170889）、抗Iba-1（1:500，Wako，Cat#:019-19741）与抗CD16/32（1:250，BD-Pharmingen，Cat#：553140）或抗CD206（1:100、R&D系统，Cat#:AF2535）抗体结合。然后在RT下用Alexa Fluor-conjugated anti-rabbit或anti-mouse IgG（1:500；分子探针）抗体孵育切片1 用DAPI对细胞核进行复染。用荧光显微镜观察切片。

Western Blot分析

如前所述进行Western blot分析(22). 使用冰镇RIPA缓冲液从5只小鼠的同侧皮层提取总蛋白。使用BCA蛋白质检测试剂盒（Thermo Fisher）检测蛋白质浓度。蛋白质样品使用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，然后转移到聚偏二氟乙烯膜。通过将膜与一级抗体孵育过夜来检测相关蛋白（即，β-actin，1:1000，CST，Cat#:4970S；TNF-α，1:10000，GeneTex，Cat#:GTX110520；IL-1β，1:1000；CST，Cat#:12242S；TLR4，1:1000、Abcam，Cat#:ab13556；NF-κB，1:1000。CST，Cat#:8482S；TGF-β，1:2000，Torrey Pines Biolabs；ZO-1，1:1000，Invitrogen，目录号：40-2200；和闭塞素，1:1000，Invitrogen，Cat#:33-1500），然后使用二级抗体（即辣根过氧化物酶结合的山羊抗兔或抗鼠IgG，1:3000，细胞信号技术）。使用Millipore ECL Western Blotting检测系统（美国马萨诸塞州Billerica市Millipore）对免疫印迹进行可视化。

脑含水量

脑含水量用于评估脑水肿。在第3天，即与TBI后最大水肿相关的时间点，处死5只小鼠(23). 处死后，将大脑沿着中线分开，并立即称重同侧半球以获得湿重（WW）。然后将组织在60°C下干燥72 h并称重以获得干重（DW）(24). 使用以下公式计算每个样品的含水量（%含水量）：（WW−DW）/WW × 100%.

横梁行走和前肢足故障

在运动功能测试中，使用高架窄梁（80 cm长 × 2.5 cm宽）提高到10 地面以上cm。在三次试验（60 s分配的时间）。动物预训练3次 CCI前天。

前肢足缺损用于确定前肢运动功能障碍。不同组的小鼠被放置在升高的水平网格上。老鼠把爪子放在电线上，同时沿着网格移动。每走一步，爪子都可能会掉下来或在电线之间滑动。如果发生这种情况，则记录为脚部故障。右前肢共记录了50步。并记录了足部缺陷的总数。小鼠接受3次训练 记录CCI前天，以及CCI后第0、3、7和14天的足部故障数。

统计分析

所有数据均表示为平均值 ± 对于多组之间的比较，先进行单因素方差分析（ANOVA），然后进行事后（post-hoc）（Bonferroni）检验用于确定显著差异。使用Student’st吨-测试。重复测量方差分析（RM ANOVA）用于束流行走和前肢足部故障。值为第页 < 0.05被认为具有统计学意义。所有分析均使用SPSS统计软件（19.0版；IBM Corporation，Armonk，NY，USA）进行。

结果

不同剂量IL-2C对TLR4/NF-κB表达及Treg细胞数量的影响

在本研究中，我们给TBI小鼠三种不同的剂量，以确定最佳剂量。结果表明，IL-2C2(0.5 微克IL-2 ± 2.5 μg抗IL-2）最有效地降低同侧皮质TLR4和NF-κB的表达。高剂量和低剂量对炎症相关蛋白的表达没有影响（图​（图2）。2). 因此，我们选择这个剂量作为后续实验的最佳浓度。

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（A）如图所示，典型的免疫印迹显示，在PBS或不同剂量的IL-2C治疗的小鼠损伤后第3天，同侧皮层TLR4和NF-κB表达。（B、C）定量评估显示IL-2C2(0.5 微克IL-2 + 2.5 μg抗IL-2）显著降低两种炎症因子的表达。数据表示为平均值 ± SD*第页 < 0.05和#第页 < 0.01.

接下来，我们使用流式细胞术测定了TBI后第3天和第7天脾脏中Tregs的数量，发现IL-2C剂量依赖性地增加Tregs百分比。Tregs在CD4中的比例+细胞数量如下：第3天，IL-2C1: 7.18 ± 0.59对24.38 ± 0.82%,第页 < 0.01; 白细胞介素-2C2: 7.18 ± 0.59对15.72 ± 0.70%,第页 < 0.01; 和IL-2C三: 7.18 ± 0.59对10.88 ± 0.82%,第页 < 0.01. 第7天，6.92 ± 0.77对20.42 ± 1.54,第页 < 0.01; 6.92 ± 0.77对7.34 ± 0.61,第页 > 0.05；和6.92 ± 0.77对6.44 ± 0.59,第页 > 分别为0.05（图​（图3三).

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（A）IL-2C剂量依赖性地增加CD4的数量+CD25抗体+Foxp3系列+脾脏中的T细胞。图表示CD25的百分比+Foxp3系列+CD4内的细胞+人口。（B）细胞计数分析表明，连续三次注射IL-2C可增加第3和第7次注射后Tregs的数量 天。数据表示为平均值 ± SD*第页 < 0.05和#第页 < 0.01(n个 = 5 小鼠/组）。

IL-2C对外周血CD4的影响+，CD8+、和NK+细胞

接下来，我们试图确定IL-2C是否影响其他淋巴细胞的群体分布。我们分离出用于流式细胞术分析的单核细胞悬浮液，发现IL-2C选择性地增加Tregs的数量，而不影响CD4、CD8或NK细胞（13.215 ± 1.47对13.785 ± 1.43,第页 > 0.05；9.8 ± 1.29对9.41 ± 1.68%,第页 > 0.05；和50.52 ± 3.26对52.88 ± 8.66%,第页 > 0.05）（图​（图44).

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流式细胞术用于计数（A）CD4细胞+,（B）CD8（CD8）+、和（C）NK1.1标准+伤后第3天从脾脏分离出细胞。我们观察到，IL-2C治疗对每个淋巴细胞亚型的比例没有影响。（D）条形图显示PBS和IL-2C处理组之间没有差异。数据表示为平均值 ± SD*第页 < 0.05和#第页 < 0.01 (n个 = 5 小鼠/组）。

IL-2C对脑内Tregs数量的影响

我们从同侧皮质分离出单核细胞，并使用流式细胞术评估Tregs的数量。我们观察到IL-2C显著增加CD4的数量+CD25抗体+Foxp3系列+受损大脑中的细胞（6.02 ± 0.56对12.48 ± 0.59,第页 < 0.01）（图​（图55).

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（A）在创伤性脑损伤（TBI）后第3天，使用不连续Percoll梯度从大脑中分离出单核细胞，并使用流式细胞术分析检测CD4内Tregs的百分比+人口。（B）在损伤后第3天，IL-2C治疗显著增加了中枢神经系统中Tregs的数量。数据表示为平均值 ± SD*第页 < 0.05和#第页 < 0.01 (n个 = 5 小鼠/组）。

IL-2C对TBI后脑含水量的影响

为了确定白细胞介素-2C的使用是否减少了脑水肿，我们使用干-WW测量了实验组的脑含水量。PBS处理组的脑含水量显著升高(第页 < 0.01），IL-2C的使用显著降低了脑含水量(第页 < 0.01). 假手术组、PBS组和IL-2C组的脑含水量为78.38 ± 0.31、82.42 ± 0.38和80.06 ± 分别为0.46%（图​（图66A） ●●●●。

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（A）72岁时测量同侧大脑半球的脑含水量 受伤后h。对照组的脑含水量显著高于假手术组，而IL-2C治疗显著降低了脑含水量(n个 = 5 小鼠/组）。（B）与PBS组相比，IL-2C治疗显著提高了束流行走速度，直到14 创伤性脑损伤（TBI）后第天。（C）IL-2C治疗从TBI后第3天起显著减少前肢足部缺陷的数量(n个 = 5 小鼠/组）。数据表示为平均值 ± SD*第页 < 0.05和#第页 < 0.01.

IL-2C对神经功能恢复的影响

为了评估全身注射IL-2C对TBI小鼠的影响，在TBI后第3天、第7天和第14天进行束流行走和前肢足部故障。与PBS组相比，IL-2C治疗显著提高了束流行走速度，测量到14 TBI后天数（图​（图6B，6B、，第页 < 0.01). 然后，IL-2C治疗显著减少了受伤后所有记录时间点前肢足部缺陷的数量（图​（图6C，6C、，第页 < 0.01).

IL-2C对皮层挫伤体积的影响

为了确定疾病进展后期IL-2C对损伤大小的影响，我们比较了损伤半球和未损伤半球的组织损失。我们观察到，在受伤后第7天，治疗组小鼠的同侧半球组织损失明显少于受伤对照组小鼠（10.94 ± 0.78对6.80 ± 0.51%,第页 < 0.01）（图​（图77).

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（A）7岁时从PBS和IL-2C处理的小鼠中获得的具有代表性的梅耶苏木精和伊红染色脑切片 脑外伤后天数（TBI）（比例尺 = 2 毫米）。（B）条形图显示，与对照组相比，IL-2C治疗导致的组织损失显著减少(n个 = 5 小鼠/组）。数据表示为平均值 ± SD*第页 < 0.05和#第页 < 0.01.

IL-2C对血脑屏障完整性的影响

紧密连接蛋白（TJs）在完整动物中以连续的方式表达，但在受伤区域中大部分被破坏24 在这项研究中，免疫荧光显示IL-2C治疗保留了CLN5表达的完整性（图​（图8A、B）。8A、 B）。此外，我们用western blot检测了TJs的表达，IL-2C治疗增加了TJsZO-1的水平（0.47 ± 0.05对0.15 ± 0.04）和闭塞素（0.66 ± 0.05与0.31 ± 0.03）（图​（图88C–E）。

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（A、B）免疫荧光染色和相对荧光强度显示，IL-2C处理保持了紧密连接蛋白（TJ）CLN5的连续性。（C–E）与PBS治疗组相比，IL-2C给药显著增加了TJs闭塞素和ZO-1的表达。数据表示为平均值 ± SD*第页 < 0.05和#第页 < 0.01 (n个 = 5 小鼠/组）。

IL-2C对中性粒细胞浸润和小胶质细胞活化的影响

脑损伤导致中性粒细胞浸润和小胶质细胞活化。为了确定IL-2C治疗是否影响这些炎症细胞，我们使用免疫组织化学方法计算小胶质细胞和中性粒细胞的数量。我们观察到，使用IL-2C导致MPO减少+PBS处理小鼠中观察到的细胞(n个 = 85.40 ± 8.44对151.40 ± 10.64个字段；第页 < 0.01）在3 受伤后天数（图​（图9A、C）。9A、 C）。Iba-1也较少+IL-2C治疗组在损伤后第3天的围输区细胞(n个 = 195.6 ± 7.64与141.4 ± 6.27/场，第页 < 0.01）（图​（图99B、 D）。

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（A、C）在创伤性脑损伤（TBI）后第3天，IL-2C显著减少了中性粒细胞在大脑中的浸润(n个 = 5 小鼠/组）。（B、D）IL-2C治疗导致损伤后第3天皮质挫伤边缘活化的小胶质细胞显著减少(n个 = 5 小鼠/组）。形态学观察表明，TBI使小胶质细胞的形态发生了剧烈变化，从拉长、分枝状变为圆形、扩大状。IL-2C治疗显著降低了细胞体大小和分枝指数。数据表示为平均值 ± SD*第页 < 0.05和#第页 < 0.01.

然后，我们还观察了不同条件下小胶质细胞的形态变化。我们观察到，TBI引起了小胶质细胞形态的剧烈变化，从细长和分叉的形状变成了圆形和扩大的外观，这暗示了大规模激活。IL-2C治疗显著降低了体细胞大小和分支指数（图​（图99B） ●●●●。

IL-2C对炎症反应的影响

小胶质细胞的M1或M2极化通常以与M1或M2表型相关的表面标志物的表达为特征。此前有报道称，脑损伤显著增加了M1表型的表达，通常会释放促炎细胞因子。我们将CD16/32与Iba-1联合标记，以确定M1细胞的频率，并发现TBI导致双标记细胞的表达显著增加（100.4 ± 5.59与4.0 ± 1.58/场，第页 < 0.01），而IL-2C治疗显著降低了围输区这些细胞的表达（65.8 ± 4.21与100.4 ± 5.59/场，第页 < 0.01）（图​（图10A、B）。10A、 B）。此外，通过western blot分析，我们发现，主要由M1小胶质细胞释放的促炎细胞因子IL-1β和TNF-α在同侧皮质的表达显著升高。IL-2C治疗显著降低IL-1β水平（第1天：1.32 ± 0.11对0.46 ± 0.05%,第页 < 0.01; 第三天：0.58 ± 0.07与0.16 ± 0.05%,第页 < 0.01）和TNF-α（第1天：0.78 ± 0.05与0.58 ± 0.04%,第页 < 0.01; 第三天：0.33 ± 0.03与0.17 ± 0.04%,第页 < 0.01）（图​（图1010C–E）。

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损伤后给予IL-2C抑制了损伤区域周围M1相关标记物的表达。（A）损伤后第3天挫伤区CD16/32与小胶质细胞标记物Iba1的共扩增显示，IL-2C治疗显著减少了M1小胶质细胞的数量。（B）细胞计数分析表明，IL-2C显著减少了CD16/32和Iba-1双阳性细胞的数量。（C–E）伤后第1天和第3天，创伤性脑损伤（TBI）诱导的同侧皮层IL-1β和TNF-α的表达被IL-2C抑制。数据表示为平均值 ± SD*第页 < 0.05和#第页 < 0.01(n个 = 5 小鼠/组）。

IL-2C对小鼠抗炎反应的影响

接下来我们评估了IL-2C对M2表型频率的影响。我们观察到IL-2C显著增加了Iba-1/CD206的数量（50.6 ± 6.39对90.2 ± 5.89,第页 < 0.01）和Arg-1（25.2 ± 3.03对49.4 ± 2.88,第页 < 0.01），与PBS治疗组相比（图​（图11A、B、E、F）。11A、 B、E、F）。TGF-β是一种重要的抗炎细胞因子，可降低活化小胶质细胞的细胞毒性。IL-2C治疗显著增加TGF-β的表达（第1天：0.15 ± 0.04与0.29 ± 0.03%,第页 < 0.01; 第三天：0.22 ± 0.03与0.85 ± 0.06%,第页 < 0.01）（图​（图1111C、 D）。

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IL-2C治疗可增加挫伤边缘M2相关标记物的表达。（A）CD206与小胶质细胞标记物Iba1的共扩增显示，IL-2C在损伤后第3天增加了挫伤区M2小胶质细胞的数量。（B）细胞计数分析表明，IL-2C显著增加CD206和Iba-1双阳性细胞的数量。（C，D）通过IL-2C治疗，创伤性脑损伤后第1天和第3天TBI诱导的同侧皮质TGF-β表达增加。（E、F）免疫组织化学显示，IL-2C处理显著增加精氨酸酶-1的数量+病变区域周围的细胞。数据表示为平均值 ± SD*第页 < 0.05和#第页 < 0.01 (n个 = 5 小鼠/组）。

讨论

在本研究中，我们使用CCI设备来制备TBI模型。与流体冲击损伤装置制作的模型不同，该装置向完整的硬脑膜输送流体脉冲，从而造成弥漫性损伤(25,26)CCI模型造成局部损伤的局部损伤。该设备的主要优点是可以精确控制变形参数（即速度、深度和持续时间），从而使TBI模型具有高度的重现性(27). 此外，CCI可以模拟局灶性损伤的全谱，并很好地转化为人类TBI。在本研究中，我们主要观察了IL-2C对损伤同侧皮层炎症和血脑屏障破坏的影响。

Tregs是一种特殊的T细胞亚型，在抑制炎症反应和维持免疫稳态方面发挥着关键作用。Yu等人表明，使用抗CD25抗体耗尽Tregs会加剧炎症反应，而过继性转移Tregs可减少炎症引起的损伤。尽管有这些证据，但过继转移的使用受到限制，因为缺乏获得足够数量和纯度的Treg的方法，以及因此需要扩增这些细胞在体外以获得足够的传输数量。因此，我们描述了一种替代性的过继转移方法，即使用低剂量的IL-2与抗IL-2复合物诱导选择性转移体内Tregs的扩展。

TLR4是TLR家族的重要成员，在脑外伤周围组织中观察到TLR4的高表达。Ahmad等人表明，TLR4基因敲除可减少与脑外伤相关的神经炎症和组织损伤事件的发生，表明以TLR4为靶点的治疗在改善TBI预后方面具有巨大潜力(28). 然后，TLR4与其下游受体相互作用，后者随后磷酸化并分解IκB。然后，NF-κB从IκB中分离并转位到细胞核中，触发多个炎症基因的转录，上调一系列炎症细胞因子的表达，如IL-1β、TNF-α和iNOS。NF-κB是一系列炎症细胞因子的主调节因子，在脑外伤周围组织中显著升高，特异性NF-κ的抑制剂显著降低TBI后炎症细胞因子表达，减轻继发性脑损伤(29). 因此，在本研究中，我们选择TLR4和NF-κB指标来评估不同IL-2C剂量的影响。我们观察到IL-2C剂量依赖性地增加Tregs的数量。常规剂量的IL-2C增加了CD4内Tregs的比例+脾脏中的TLR4和NF-κB p65显著上调。半剂量可抑制炎症反应，同时使Tregs的比例增加约两倍。其中一个原因可能是过量的Tregs剥夺了机体适度免疫炎症反应的有益作用，而这种免疫炎症反应是生理功能所必需的，有助于损伤组织的修复(30,31).

流式细胞术分析表明，IL-2C治疗可增加同侧皮层Tregs的数量。Tregs增加与脑水肿减少、病变体积减少和神经功能恢复改善有关。这些有益作用可能通过减少BBB破坏和促炎反应以及增加抗炎反应来介导。

血脑屏障对维持中枢神经系统内稳态至关重要(32,33). 血脑屏障的关键成分是由内皮细胞形成的脑血管。EC具有连续的细胞间TJ，限制分子通过EC层的细胞旁和跨细胞运动(34). TBI破坏BBB并通过破坏紧密连接复合体、扩大细胞间隙、压扁和压缩血管系统以及减少血管管腔而导致损伤，所有这些都会导致细胞肿胀(35). 被破坏的血脑屏障随后允许循环细胞和许多血液传播物质进入大脑。这些白细胞的过度积累导致释放大量细胞因子（即细胞毒酶、炎症介质和活性氧物种），从而进一步损害微血管内皮和TJ。在本研究中，IL-2C治疗增加了TJs（ZO-1、闭塞和克劳丁-5）的表达，表明Tregs的增加可能能够维持BBB的完整性。然后，正如我们观察到的那样，相对完整的屏障减少了白细胞向中枢神经系统的渗透。

小胶质细胞是先天免疫的重要组成部分，在炎症反应中发挥重要作用(36). 小胶质细胞的激活与吞噬功能增强、各种免疫调节因子上调以及炎症和细胞毒性分子的分泌有关，从而导致继发性神经元损伤(37,38). 减少小胶质细胞的过度激活可以保护大脑免受炎症损伤(39). 此外，小胶质细胞具有很高的可塑性，在TBI后会改变其形态。报告显示，静止的小胶质细胞表现出分支细胞形态，胞体相对较小，分支较细，而活化的小胶质胶质细胞则逐渐减少分支，并迅速形成一个扩大的细胞体，其中有几个短的，枝条加厚，形成圆形变形虫状外观(40,41). 在本研究中，我们发现IL-2C治疗可以显著降低小胶质细胞的过度激活以及小胶质细胞胞体大小和分支指数。

如前所述，小胶质细胞有两种不同的表型——经典激活型（M1）和交替激活型（M2）小胶质细胞(42). 越来越多的证据表明，M1小胶质细胞是一种与组织破坏相关的促炎亚型，而M2小胶质是一种促进修复和再生的抗炎亚型(21,43,44). TBI激活经典M1和替代M2表型。然而，M2活性在损伤后几天内下降，而M1活性在TBI后保持升高的时间更长，并随着时间的推移加剧损伤(45,46). 此外，小胶质细胞可能在特定的微环境中从一种表型转移到另一种表型(47). 均表明M2极化小胶质细胞可以解决过度炎症并促进组织修复(36,48). 在这项研究中，我们通过分析挫伤边缘的M1或M2表型来评估小胶质细胞的大脑极化。对于免疫荧光，我们将CD16/32或CD206与Iba-1联合标记，以定义小胶质细胞的M1或M2表型，因为只有一个标记物无法确定小胶质细胞表型。我们观察到，TBI激活了大量小胶质细胞，导致M1相关标记物（即CD16/32、IL-1β、TNF-α）的表达显著增加。IL-2C治疗降低了M1相关标志物的表达，同时增加了M2相关标志物（即CD206、精氨酸酶1、TGF-β）的表达。我们的数据清楚地表明，IL-2C治疗促进了同侧皮质小胶质细胞/巨噬细胞的M2极化。

总之，IL-2C治疗显著增加了Tregs的数量，且呈剂量依赖性。与在其他疾病中观察到的情况不同，在该模型中，常规剂量对伤口愈合有害，而半剂量可以减少脑水肿、组织丢失，并促进神经功能恢复。此外，IL-2C还可以减轻BBB的降解，降低M1相关标记的表达，增加M2相关标记表达。此外，本研究存在局限性，需要进一步研究来评估IL-2C对假动物的潜在影响。

道德声明

本研究是根据中国天津医科大学总医院动物护理与伦理委员会的建议进行的。该方案得到了中国天津医科大学总医院动物护理与伦理委员会的批准。

作者贡献

WG、FL和ZZ是第一作者。工作组：设计研究，执行TBI模型和流式细胞术，并撰写手稿。FL和ZZ：制备药物溶液并进行组织学检查和western blot。XX和YW：进行了western blot和动物研究。SZ和DY：检测水含量。DS和JX：评估梁行走和前肢足故障。RJ和JZ：参与了研究的设计和分析，并撰写了手稿。所有作者都批准了手稿的最终版本。

利益冲突声明

作者声明，该研究是在没有任何可能被解释为潜在利益冲突的商业或金融关系的情况下进行的。

致谢

本研究得到了国家自然科学基金（81271361和81330029）和天津市自然科学基金会（13JCZDJC30800和15JCYBJC50500）的资助。

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