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科学代表。2016; 6: 21960.
2016年2月26日在线发布。 数字对象标识：10.1038/srep21960
预防性维修识别码：项目经理4768148
PMID：26916681

肾肿瘤坏死因子α与Dahl盐敏感大鼠高血压的关系

黄宝瑞,1,2,4 袁诚,三，4,5 克里斯蒂·乌萨,三，4 刘勇（音）,三，4 玛丽亚·安吉莱斯·贝克,三，4 大卫·L·马特森,4 何永成,5 王念松,a、，1和梁明玉b、，三，4
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

肿瘤坏死因子α（TNFα）是一种主要的促炎细胞因子，在高血压状态下其水平升高。高血压发展过程中肾脏发生炎症。我们假设肾脏中特异性的TNFα参与Dahl盐敏感性（SS）大鼠高血压和肾损伤的发展，这是一种广泛使用的人类盐敏感性高血压和肾损害模型。在清醒、自由活动的状态下，对SS大鼠进行慢性肾间质输注和血压测量。使用实时PCR检测基因表达，并通过组织学分析评估肾损伤。SS大鼠肾髓质中TNFα的丰度，而非盐敏感性同类SS.13BN26型当大鼠被喂以高盐饮食7天后（n = 6或9，p < 0.01). SS大鼠肾髓质中TNFα受体的丰度显著高于SS.13BN26型胡扯。肾间质注射TNFα抑制剂Etanercept可显著减轻高盐饮食（n = 7-8页 < 0.05). 肾小球硬化和间质纤维化也显著改善。这些发现表明肾内TNFα参与了SS大鼠高血压和肾损伤的发展。

高血压是一个主要的公共卫生问题1盐是导致高血压发展的主要环境因素之一2Dahl盐敏感性（SS）大鼠是人类盐敏感性高血压和肾损伤最常用的多基因动物模型3.

炎症被认为是高血压发展的重要因素，包括SS大鼠的盐诱导高血压。与Dahl耐盐大鼠相比，高盐饮食喂养的SS大鼠的循环白细胞计数显著升高4高盐饮食治疗的SS大鼠肾间质炎症和免疫细胞浸润明显5,6抑制炎症和免疫反应的药理学或遗传学操作可减少免疫细胞的肾间质浸润，并减轻SS大鼠和其他模型中盐诱导的高血压和肾损伤7,8,9,10.

肿瘤坏死因子α（TNFα）是一种主要的促炎细胞因子，据报道在高血压患者中升高11,12系统性服用Etanercept（一种可阻断TNFα功能作用的可溶性重组融合蛋白）可减轻几种模型中高血压和肾损伤的发展13,14,15.

然而，尚不清楚肾脏中的TNFα是否与高血压有关。在本研究中，我们分析了SS大鼠肾脏中TNFα及其受体的表达水平。然后，我们通过向肾间质局部直接注入依那西普，检测肾内TNFα对高血压的作用。肾间质输注或注射是一种公认的实验技术，用于将药物专门注入肾脏16,17,18,19将该技术应用于有意识的动物时，需要复杂的慢性器械。

方法

动物

动物实验按照美国国立卫生研究院《实验动物护理和使用指南》中的建议进行。动物实验方案由威斯康星州医学院动物护理和使用委员会（AUA206）批准。近交SS大鼠和同源SS大鼠。BN-（D13Rat151-D13Rat197）/Mcwi（也称为SS.13BN26型)威斯康星州医学院生产了血压降低的盐敏感性大鼠。老鼠在12:12 h光-暗循环，可以无限接触水。外螺纹SS和SS.13BN26型如前所述，将大鼠维持在含有0.4%氯化钠的AIN-76A饮食中20,21,22,23,24,25.

实时PCR

收集肾组织，提取RNA，并按照前面所述进行实时PCR22,26,27,2818S rRNA被用作内部标准化物。引物序列如所示表1.

表1

实时PCR引物序列。
基因名称 底漆顺序
18s rRNA正向底漆5′-CGGCTACCACACAAGAA-3′
反向底漆5′-CCTGTATTTTTTTTTCGTCACTACT-3′
肿瘤坏死因子α正向底漆5′-TGGGCTCCCTCTCATCAGTTC-3′
反向底漆5′-TCCGCTTTGGTGGTTGCTAC-3′
Tnfrsf1A型正向底漆5′-CAAAGAGGTGAGGGGTGAAGG-3′
反向底漆5′-ACTGAAGCGTGTGGTG-3′
Tnfrsf1B型正向底漆5′-TTAGAGGAGCCAGTTGTTACCA-3′
反向底漆5′-gacgtgtccttcgcttctc-3′

肾间质灌注和血压测量的慢性仪器

如前所述，对大鼠进行肾间质灌注和血压测量的慢性器械24,28,29,30,31简单地说，6周龄的SS大鼠接受了单侧肾切除术以切除右侧肾脏，使剩余肾脏成为大鼠肾功能的唯一决定因素。恢复一周后，将一根输液导管植入剩余左肾的间质，另一根导管植入左股动脉。两个导管均从颈部后部取出，并用旋转接头连接到输液泵或血压传感器。该制剂允许清醒、自由运动的大鼠进行慢性肾间质灌注和动脉血压测量。在开始通过动脉导管记录每日血压之前，让大鼠再恢复一周。在获得稳定的血压基线3天后，以0.25的剂量连续在肾间质输注TNFα抑制剂Etanercept（Enbrel、Amgen、千橡，CA） mg/kg/天，或盐水对照。再过3天，大鼠从0.4%氯化钠饮食转变为4%氯化钠饮食（染料）。在对大鼠实施安乐死并收集组织之前，继续进行8天的间质灌注和血压测量。

组织学分析

肾脏用10%的磷酸盐缓冲福尔马林固定24小时 在室温下放置数小时，然后包埋在石蜡中。剖面图由3个 μm厚，用Masson三色染色。所有幻灯片均通过Nanozoomer数字病理扫描，并通过Metamorph脱机版本7.7.0.0软件进行分析。根据前面描述的肾小球硬化程度评估肾小球（每张幻灯片90到120分）（从0到4分）32如前所述，对间质纤维化、肾小管铸型、尿蛋白和白蛋白排泄进行分析33,34,35.

免疫组织化学

在福尔马林固定、石蜡包埋的SS大鼠肾脏切片中进行免疫组织化学（n = 6–9），遵循与我们之前描述的程序类似的程序33,34,35。所有来自Abcam的初级抗体和使用的稀释液分别为ab6671（TNFα）、1:100、ab19139（TNF受体I）、1:1500和ab109322（TNF接收器II），1:100。

统计

使用学生t检验或双向RM方差分析来分析数据。P（P） < 0.05被认为是显著的。数据显示为平均值 ± 扫描电镜。

结果

采用实时荧光定量PCR检测SS大鼠肾髓质中TNFα及其受体的表达。同质SS.13BN26型与SS大鼠相比，我们发现大鼠的血压盐敏感性水平较低25,36，作为盐敏对照。4%（n）处理的SS大鼠TNFα丰度显著增加 = 9） 或8%（n = 6） 食盐饮食7天，而这种变化发生在8%食盐饮食的3到7天之间(图1A、B). 在SS.13中，7天的4%氯化钠饮食不会改变TNFα的丰度第26页老鼠(图1A). SS大鼠TNFα受体Tnfrsf1A和Tnfrsf1B的mRNA丰度显著高于SS.13BN26型老鼠(图1C、D). 然而，用4%氯化钠饮食治疗7天并没有显著改变两种大鼠中Tnfrsf1A或Tnfrsf1B的mRNA丰度。SS大鼠肾髓质的免疫组织化学分析表明，肾小管细胞和可能浸润的炎性细胞中存在TNFα蛋白，特别是在高盐饮食治疗后(图1E). TNF受体II由Tnfrsf1B编码，在肾髓质的小管细胞中可检测到，而TNF受体I由Tnfrs f1A编码，仅在高盐饮食治疗后的大鼠小管中可检测出。

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SS和SS.13肾髓质中TNFα及其受体Tnfrsf1A和Tnfrsf1B的丰度BN26型胡扯。

(A类)与SS大鼠0.4%NaCl饮食（n = 9，**P < 0.01）或盐敏SS.13BN26型大鼠（#P < 0.01). (B类)8%氯化钠饮食7天后SS大鼠TNFα丰度显著增加（n = 6，**P < 0.01与0.4%氯化钠饮食*P（P） < 0.05 vs.3天的8%氯化钠饮食）。(C类,D类)SS大鼠TNFα受体Tnfrsf1A和Tnfrsf1B的丰度显著高于SS.13BN26型大鼠（n = 9，#P < 0.01相对于SS）。(E类)免疫组织化学分析。SS大鼠肾脏髓质区域的代表性图像维持在0.4%NaCl饮食或喂养4%NaCl食物7天（n = 6–9）。阴性对照中省略了一级抗体。棕色表示染色阳性。箭头指向似乎正在浸润炎症细胞的细胞。比例尺为50μm。

我们通过在肾间注射TNFα抑制剂Etanercept治疗单侧肾切除的SS大鼠，检查肾内TNFα是否导致SS大鼠高血压。单肾切除术使接受Etanercept的剩余肾脏成为全身肾功能的唯一决定因素。当大鼠维持在0.4%氯化钠饮食中时，肾间质注射依那西普3天对平均动脉压没有显著影响。然而，在大鼠改用4%氯化钠饮食（n = 7-8，P < 0.05与生理盐水对照组在第3至8天的4%氯化钠饮食中，进行双向RM方差分析，然后进行Holm-Sidak检验）(图2). 依那西普的疗效达到22 在大鼠切换到高盐饮食后8天，mmHg。

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肾间质给药依那西普可减轻SS大鼠盐诱导高血压的发展。

未肾切除术的SS大鼠接受盐载体或依那西普（0.25）的连续肾间质灌注 mg/kg/天），并在指定的持续时间内喂食0.4%或4%氯化钠饮食。使用留置的股动脉导管测量清醒、自由活动的大鼠的平均动脉血压（MAP）。N个 = 7-8，*p < 0.05 vs.车用大鼠。

SS大鼠除高血压外，还出现严重的肾损伤，这一特征与非裔美国人高血压相似28肾间质注射依那西普可显著降低严重受损肾小球的百分比和纤维化肾皮质的百分比(图3A-C). 依那西普治疗并未显著改变肾管型占肾段面积的百分比或24 小时尿白蛋白或蛋白质排泄(图3D，E).

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肾间质注射依那西汀SS大鼠可改善肾小球硬化和肾间质纤维化。

(A类)严重受损的肾小球百分比（得分4）。(B类)肾皮质纤维化区域的百分比。(C类)肾脏切片的代表性图像。箭头指向受伤的肾小球。(D类)肾管型占肾脏截面积的百分比。E.尿24 白蛋白（Ualb）或总蛋白（Uprot）的小时排泄量。N个 = 4–8，*P < 0.05 vs.车用大鼠。

讨论

本研究的主要新发现是，直接向肾间质注射依那西普可显著减轻SS大鼠盐诱导的高血压。我们观察到的依那西普的降压作用很可能是肾脏中特异性TNFα抑制的结果，而不是任何依那西普对TNFα的全身抑制溢出到体循环中的结果。使用放射性标记化合物的实验表明，注入肾间质的化合物大部分留在注入的肾脏中37。即使一小部分依那西普确实溢出进入了体循环，溢出也不太可能解释我们观察到的血压效应。在本研究中，全身给药的依那西泮剂量通常比注入肾间质的总剂量高5至10倍13,14,38,39注意，尽管肾间质给药主要用于解决有关肾脏贡献的机制问题，而不是作为一种治疗方法。

在本研究之前，尚不清楚肾脏中特异性的TNFα是否在高血压的发展中起重要作用。一些研究报告称，用TNFα抑制剂Etanercept进行系统治疗可改变高血压的进展13,40然而，尚不清楚是全身性还是局部性TNFα参与。此外，TNFα是否有助于增加或在某些情况下降低血压似乎取决于存在的TNFα水平41。当前研究结果表明，考虑肾脏局部TNFα水平非常重要。TNFα不太可能是唯一参与炎症反应的细胞因子。重要的是要考虑其他促炎因子的作用。

先前的研究报道，在4%氯化钠饮食5周后，SS大鼠肾脏中的TNFα增加42我们的数据表明，SS大鼠肾脏TNFα的上调发生在高盐饮食暴露后7天内的早期。肾脏中的TNFα可能来自多种来源，包括浸润肾脏的巨噬细胞和淋巴细胞、肾脏中的常驻细胞和循环TNFα。肾脏固有上皮细胞产生的TNFα可能在调节电解质稳态中发挥生理作用43在本研究中，特别是在高盐饮食治疗后，在SS大鼠的肾小管细胞和可能浸润的炎性细胞中检测到TNFα，尽管每种细胞类型的相对贡献仍有待确定。我们不知道肾髓质释放的TNFα是否或多少有助于增加全身TNFα。SS大鼠肾脏TNFα导致高血压的下游机制仍有待研究。

其他信息

如何引用这篇文章：黄，B。等。肾肿瘤坏死因子α与Dahl盐敏感大鼠高血压的关系。科学。代表。 6, 21960; doi:10.1038/srep21960（2016）。

鸣谢

这项工作得到了美国国立卫生研究院拨款HL121233、HL082798和HL116264的支持。伯克希尔哈撒韦得到了中国奖学金委员会的部分支持。

脚注

作者贡献B.H.、Y.C.和K.U.进行了实验。Y.L.、M.A.B.、D.L.M.和Y.H.协助了实验。B.H.和Y.C.分析了数据。B.H.和N.W.参与了研究设计和数据解释。M.L.构思并设计了这项研究。B.H.和M.L.起草了手稿。所有作者都为手稿的撰写提供了意见。

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