脑天生免疫调节下丘脑弓状神经活动和进食行为

电生理学

如前所述，获得了传统的全细胞补丁灯记录(25). 简单地说，雄性大鼠（n=29）或GFP-NPY小鼠（n=16，雄性=8，雌性=8）被麻醉，并收获大脑。使用振动切片机切割包含弓状核的冠状下丘脑切片（230μm）。对于电生理记录，将切片转移到潜水式记录室，持续灌注（～2 mL/min⁻¹30–32°C），标准人工脑脊液（ACSF）以95%O的气体混合物起泡₂和5%CO₂.贴片吸管内溶液包含（毫摩尔）：K-葡萄糖酸130、KCl 20、HEPES 10、EGTA 0.5、Mg-ATP 0.9和Na-GTP 0.3。pH值缓慢滴定至7.25–7.30。在用脂多糖（LPS-EK，10μg/mL；目录号tlrl-eklps；InvivoGen）激活TLR4之前和期间，在电流灯模式下，记录用盐酸米诺环素（Minoc，100μM；Sigma-Aldrich）预处理或未预处理（1–2 h）的切片中的点燃活性。点火率（定义为峰值数，秒⁻¹)在对照期（用药前2分钟）和LPS给药后1分钟开始的一段时间（8-9分钟）内进行测量。如果在对照组和LPS给药组之间观察到放电率变化至少10%，则认为神经元有反应。详细方法见补充材料和方法.

荧光免疫组织化学

为了研究小胶质细胞在ARC内的分布，对雄性大鼠（n=4）进行深度麻醉，并用0.01M PBS（150mL，pH 7.4）和4%多聚甲醛（350mL）经心灌注。大脑被移除，并在4°C下用4%多聚甲醛固定3小时。通过短角−2.12和−2.8之间ARC核的连续冠状切片（25μm）(26)用冷冻器切割并在初级抗体中孵育24小时(表1)用于IBA1单染色的兔小胶质细胞标记物抗电离钙结合衔接分子1（IBA1）抗体（019-19 741，1:200；Wako）、用于AgRP和POMC共染色的豚鼠抗AgRP多克隆抗体（ab181493，1:500；Abcam）和山羊抗POMC抗体（ab32893，1:300；Abcam）。为了确定TLR4是否在ARC小胶质细胞中表达，在山羊抗IBA1抗体（ab5076，1:1000；Abcam）和兔抗TLR4抗体（ab13556，1:200；Abcam）的混合物中培养不同的切片。与一级抗体反应后，在（a）荧光标记的二级抗体（Jackson Immunoresearch Laboratories）驴抗兔Cy5（1:250，用于IBA1）、驴抗豚鼠Cy3（1:250；用于AgRP）和马抗血清荧光素异硫氰酸盐（用于POMC）存在下孵育4小时或马抗血清Cy5（用于IBA1）和马抗兔血清Cy3（用于TLR4）。切片也用TOTO3进行复染（1:10 000，15分钟；分子探针），然后用共焦显微镜进行安装和可视化。详细方法见补充材料和方法。

共焦成像

如前所述，使用阈值范式量化免疫荧光强度(27). 使用POMC和AgRP免疫反应作为解剖标志物，手动追踪ARC核，以描绘富含POMC（侧ARC方面）和AgRP（内侧ARC方面(28,29). 随后，使用包含目标信号（IBA1）的信道。从缺乏免疫反应信号的区域的图像中减去背景荧光，并将阈值设置为背景荧光强度的1.5倍。使用相同的标定区域获得感兴趣追踪区域内IBA1阈值信号的密度，并表示为阈值面积的百分比（即包含阈值免疫反应信号的总面积的百分比）。平均免疫反应强度也来自相同的区域，并表示为任意单位（AU）(27). 详细方法见补充材料和方法。

脑室注射Minoc和ghrelin

为了抑制小胶质细胞活性和注射ghrelin，将侧脑室内（ICV）灌注探针（引导探针）放置在侧脑室（n=29只雄性大鼠）。ICV坐标系改编自先前的研究(30). 在大鼠术后恢复10天后进行急性ICV输注Minoc（100μg/5μL载剂）和/或ghrelin（10μg/5微升载剂），并于9:00注射化合物上午（灯亮后2小时）通过将注射针插入导向探头。注射后2小时和4小时测量食物摄入量。为了进行更长期的研究，ICV-Minoc输注5天。第5天，9:00注射ICV ghrelin上午6小时后测量食物摄入量。

TLR4激活引起小鼠AgRP/NPY神经元的抑制反应

为了更确切地解决细胞类型依赖性ARC对TLR4激活的反应，我们在转基因GFP-NPY小鼠中进行了记录，其中根据GFP的表达很容易识别AgRP/NPY神经元(31). 补充图2显示了小鼠下丘脑切片中记录的GFP-NPY神经元的典型示例。与大鼠ARC神经元类似，当受到超极化保持电位（−90 mV）增加幅度的去极化步骤时，小鼠中的大多数GFP-NPY和非GFP-NPYARC神经元显示出较大的LTD（补充图2）。对LPS反应最灵敏的GFP-NPY神经元（16个中的14个，87.5%）表现出放电减少（基线，0.63±0.12 Hz；LPS，0.09±0.03 Hz，P（P）>0.05，配对t检验）(图3、A和B）。然而，这种抑制并没有伴随着膜超极化(图3C） ●●●●。其余反应神经元（16个中的2个，12.5%）的放电活动增强。在这些小鼠中，只检测到两个AgRP/NPY神经元(18)都没有反应。在雄性和雌性小鼠之间比较数据时，观察到类似的LPS介导的放电活性降低（补充图3）。最后，与从大鼠ARC神经元获得的记录类似，我们未能揭示放电率百分比变化与所有GFP-NPY神经元接受TLR4激活后膜电位变化之间的强烈而显著的相关性（r²= 0.45,P（P）= .06).

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图3。

TLR4激活抑制小鼠中大多数GFP-NPY神经元。

A、 在没有或存在Minoc（100μM）的情况下，ARC GFP-NPY神经元对LPS（10μg/mL）反应的发生率总结。B、 LPS对GFP-NPY平均燃烧活性影响的条形图和典型示例。C、 膜电位的平均变化。D、 Minoc存在下LPS对GFP-NPY平均放电活动影响的条形图和代表性示例。E、 膜电位的平均变化（n=神经元数量）。数据表示为平均值±SEM.+，P（P）<.05（成对t吨在自己的组内测试）。*，P（P）与Minoc（无LPS）组（成对）相比<0.05t吨测试）。

相反，在大多数非GFP NPY神经元（七分之四，57.1%）中，TLR4激活引起放电活性增加（未显示）。这些数据与我们在大鼠内侧ARC-AgRP/NPY神经元中获得的结果一致（参见图1C和​和2A）2A） 支持TLR4主要引起AgRP/NPY活性降低和POMC ARC神经元活性增加的一般观点。

抑制活化的小胶质细胞可阻止TLR4介导的AgRP/NPY作用，但不能阻止POMC神经元的作用

研究表明，TLR4s存在于ARC的小胶质细胞中，在代谢性疾病期间其表达增加(10,12,14,19). 然而，ARC中小胶质细胞的激活是否会影响局部神经元的活动尚未被研究。因此，为了测试TLR4介导的对ARC神经元活性的影响是否通过小胶质细胞活化间接介导，我们测试了抑制小胶质细胞激活的四环素衍生物Minoc的作用(32,–35). 在从小鼠已鉴定的GFP-NPY神经元获得的记录中(图3（A、D和E），我们发现，在Minoc存在的情况下，大多数GFP-NPY神经元未能表现出对TLR4激活的放电活动的改变（九分之五，55.6%）。然而，仍观察到一小部分（<2 mV）被认为是显著的膜去极化(图3E） ●●●●。在这种治疗中，九个神经元中只有三个（33.3%）仍显示放电率下降（基线为0.41±0.13 Hz；LPS为0.42±0.13赫兹），且没有出现膜超极化(图3、D和E）。总之，GFP-NPY神经元中大多数TLR4介导的抑制反应在米诺环素的存在下被钝化，导致在比较ACSF和Minoc神经元中TLR4反应时，反应类型的发生率存在总体差异(P（P）> .05, χ²测试）。

与我们在对照条件下观察到的大鼠ARC神经元不同（即兴奋和抑制反应神经元的比例大致相等）(图1B类)用Minoc预处理1-2小时的大鼠切片中TLR4的激活(参见材料和方法)导致大多数反应性神经元的放电活动增强（22/29，～76%），而少数神经元的放电活性降低（7/29，～24%）(图4A） ●●●●。当我们随后根据大鼠ARC神经元的地形分布分析它们时，我们发现在Minoc存在的情况下，大鼠内侧ARC神经元反应模式发生了完全改变(图4、B和C）。因此，与我们在控制条件下观察到的不同（参见图1C和​和2C），2C） ，大多数内侧ARC神经元（15个中的11个，～73%）对TLR4激活表现出兴奋性反应，其特征还表现为膜去极化（基线，−39.7±2.35 mV；LPS，−33.1±2.77 mV）和放电增加（基线，1.31±0.17 Hz；LPS（2.07±0.22 Hz），P（P）两个变量均<0.05，成对t吨测试）(图4，C和D），而仅在其余的患者中观察到抑制反应（4/15，～27%）(图4B） ●●●●。因此，对照ACSF和Minoc存在时，内侧ARC神经元反应类型的总体发生率有显著差异(P（P）> .05, χ²测试）。

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图4。

抑制激活的小胶质细胞可阻止TLR4介导的ARC神经元内侧而非外侧活动的抑制。

用Minoc（100μM）预孵育的切片中LPS（10μg/mL）引起的兴奋性和抑制性神经元反应的发生率总结，观察到混合的ARC神经元（A）或根据ARC侧面或内侧的神经元分布（B）。条形图顶部的数字是每组神经元的数量。在用Minoc（100μM）预孵育的切片中应用LPS（10μg/mL）后，位于ARC内侧的神经元的放电活性（C）和膜电位（D）的平均变化。在用Minoc（100μM）预孵育的切片中应用LPS（10μg/mL）后，位于ARC侧面的神经元的放电活动平均变化（E）和膜电位平均变化（F）。每组中最主要响应的代表性示例显示在面板C和E中的迹线中。数据表示为平均值±SEM.+，P（P）<.05（成对t吨在自己的组内测试）；*，P（P）与Minoc（无LPS）组（成对）相比<0.05t吨测试）。

相反，Minoc不影响外侧ARC神经元对LPS的反应(图4、B和E）。因此，与我们在对照条件下观察到的情况类似，TLR4激活在14例中的11例（～79%）中诱导兴奋性反应，其特征是显著的膜去极化（基线，−42.89±1.91 mV；LPS，−38.06±1.68 mV）和放电增加（基线，0.92±0.20 Hz；LPS（1.50±0.29 Hz），P（P）两个变量均<0.05，成对t吨测试）(图4、B、E和F）。因此，对照ACSF和Minoc存在时，外侧ARC神经元反应类型的总发生率没有显著差异(P（P）> .9, χ²测试）。综上所述，我们的结果表明，在小胶质细胞抑制剂的存在下，AgRP/NPY神经元中TLR4激活引起的抑制性（而非兴奋性）反应在很大程度上减弱，支持小胶质细胞对ARC中神经元调节的细胞类型依赖性贡献。

TLR4介导小鼠弓状神经元LPS抑制作用

TLR4是主要的LPS受体，主要在小胶质细胞中表达，并介导小胶质细胞对LPS的反应(19,20). 然而，考虑到LPS对ARC神经元活动的不同细胞类型依赖性效应以及小胶质细胞对这些效应的细胞类型依赖贡献，我们研究了TLR4对LPS介导效应的确切贡献。为此，我们使用纯化的抗小鼠TLR4单克隆抗体(表1)，先前证明可有效中和TLR4对LPS的反应(36). 由于该抗体仅与小鼠TLR4反应，因此在从雄性C57BL小鼠（n=4）获得的ARC脑片上进行了实验。切片在含有0.1μg/mL mTLR4抗体的ACSF中预孵育约3.5小时，然后如上所述进行LPS应用。如所示图5，在TLR4抗体存在的情况下对LPS的抑制反应被消除（1/11），而兴奋反应仍然持续（6/11）(图5A） ●●●●。这种情况下的平均射速变化如所示图5B（兴奋性反应值：基线，0.46±0.19 Hz；LPS，0.82±0.29 Hz，P（P）<0.05，成对t吨试验），不伴有膜电位的变化(图5C） ●●●●。这些结果与Minoc（大鼠和小鼠）的结果基本一致，Minoc的抑制反应减弱，但兴奋反应减弱。

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图5。

TLR4阻断可消除小鼠ARC神经元中LPS诱发的抑制反应。

A、 小鼠ARC神经元对LPS（10μg/mL）反应的发生率总结，该反应在含有纯化的鼠抗单克隆抗体（mTLR4抗体，0.1μg/mL，）的预培养切片中进行。B、 条形图总结了LPS对平均放电活动的影响。C、 存在mTLR4抗体时膜电位的平均变化（n=神经元数量）。数据表示为平均值±SEM.+，P（P）<.05（成对t吨在自己的组内测试）；*，P（P）与mTLT4（无LPS）组（配对t吨测试）。

ARC中小胶质细胞的地形分布和TLR4的表达

小胶质细胞标记物IBA1对小胶质细胞的免疫染色(37)用于评估小胶质细胞在ARC内的分布，这通过POMC和AgRP免疫染色进一步描述。虽然我们的结果显示POMC体细胞染色较强，但AgRP仅标记薄突起，如前所述，这些突起在含ARC的POMC神经元的侧面富集（参见图6A）(28,29). 因此，为了定量目的，我们比较了外侧POMC富集区和内侧POMC阴性区的IBA1染色（参见图6，A1–A3）。有趣的是，尽管在整个ARC中观察到IBA1染色的小胶质细胞，但它们似乎是不均匀分布的，具有显著更高的优势，如较高的IBA1密度和强度信号所示（POMC，58.5±4.1 AU；非POMC，49.9±3.7 AU，P（P）<0.05，成对t吨与更内侧的POMC阻塞区相比，ARC的外侧POMC富集区（参见图6B） ●●●●。

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图6。

大鼠ARC中小胶质细胞的地形分布和小胶质TLR4的表达。

A1，代表性共焦显微照片，显示ARC.A2中AgRP（红色）和POMC（绿色）的免疫荧光染色。相同的图像显示了用于量化的POMC（侧面）和非POMC（中间）区域的线。A3，IBA1阳性（白色）小胶质细胞的免疫荧光染色。A3中的数字表示所显示弓形的每个子区域的IBA1密度值。B、 显示POMC和非POMC ARC区域之间IBA1染色强度（左侧面板）和密度（右侧面板）的平均差异的汇总数据。C、 共焦显微照片显示ARC中TLR4（红色）和IBA1（蓝色）染色。注意小胶质细胞中存在TLR4染色（紫色）。数据表示为平均值±SEM.*，P（P）与POMC组相比<0.05（成对t吨测试）。3V，第三脑室。

为了确定ARC小胶质细胞是否表达TLR4，我们使用小鼠脑组织，因为我们测试的TLR4抗体与小鼠组织反应（它也与人体组织反应，但在本研究中不适用）。如中的典型示例所示图6C、 我们在ARC内IBA1染色的小胶质细胞内发现了相当程度的TLR4阳性染色。

这项工作得到了国家心脏、肺和血液研究所的部分支持国家卫生研究院拨款HL112225（发给J.E.S.）和亥姆霍兹联盟ICEMED（成像和治疗环境代谢疾病），通过亥姆霍茨协会倡议和网络基金。

披露摘要：作者无需披露任何信息。