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免疫学杂志。作者手稿；PMC 2015年2月18日提供。
以最终编辑形式发布为：
免疫学杂志。2013年8月15日；191(4): 1865–1872.
在线发布2013年7月10日。 数字对象标识：10.4049/jimmunol 1203070
预防性维修识别码：项目经理4332536
NIHMSID公司：NIHMS494859
PMID：23842751

组氨酸-tRNA合成酶诱导的小鼠肌炎模型中MyD88依赖性信号通路的功能冗余

伊琳娜·费尔南德斯,* 丽莎·哈洛,* 云娟臧,* 如流-布莱恩,† 威廉·里奇韦,‡ 保拉·克莱门斯,§和达纳·P·阿斯切曼*
作者信息 版权和许可信息 PMC免责声明

关联数据

补充资料

摘要

我们之前已经证明，肌肉注射细菌表达的小鼠组氨酸-tRNA合成酶（HRS）会在各种同类小鼠中触发红肿的肌肉炎症（相对于适当的对照蛋白）。由于即使在缺乏对HRS的适应性免疫反应的情况下也会出现严重疾病，因此我们试图确定导致HRS诱导的肌炎模型的固有免疫信号成分。体外刺激试验表明，HRS介导的TLR2或TLR4转染HEK293细胞的激活，显示其兴奋能力超过其他细菌表达的融合蛋白。与TLR信号通路的这种明显功能冗余相对应，B6.TLR2的HRS免疫−/−和B6.TLR4−/−单基因敲除小鼠产生了与C57BL/6 WT小鼠相当的肌肉组织淋巴细胞浸润。相反，B6.TLR2中TLR2和TLR4信号的伴随消除−/−.TLR4级−/−双基因敲除小鼠显著降低了HRS诱导的肌肉炎症的严重程度。互补亚片段分析表明，HRS的60–90氨基酸绝对需要通过这些MyD88依赖性TLR途径进行体外和体内信号传递，部分通过能够激活特定TLR的外源配体的优先结合介导效应。总之，这些实验表明多个MyD88依赖性信号级联有助于HRS诱导的肌炎模型，强调了HRS的抗原多功能性，并证实了先天免疫在该系统中的重要性。

简介

特发性炎性肌病（IIM）包括一组多系统自身免疫性疾病，其中异常免疫反应以肌肉和肌外器官为目标(1–三). 除了器官受累的特征模式外，明确的自身抗体有助于区分IIM患者的临床亚群(4,5). 这些自身抗体中最主要的是与肌炎、关节炎、雷诺氏现象、“机械手”、发热和间质性肺病等多种综合征相关的抗合成酶抗体(6). 尽管有大量数据支持抗合成酶抗体与临床病程/疾病活动之间的联系，但这些自身抗体和相应抗原特异性T细胞在疾病发病机制中的确切作用仍不明确。

随着研究人员寻求tRNA合成酶与抗合成酶综合征之间显著关系的免疫学基础，这些假定的自身抗原对潜在疾病发病机制的贡献可能超出了传统的适应性免疫范式。根据Wakasugi的开创性观察，酪氨酸-tRNA合成酶的亚片段可以作为生物活性细胞因子发挥作用(7)，一些tRNA合成酶可能能够触发先天免疫反应的概念逐渐确立。事实上，通过一系列优雅的体外研究，Howard等人随后证明了两种已知的肌炎自身抗原——组氨酸tRNA合成酶（HRS=Jo-1）和天冬酰胺tRNA合成酶（ARS=KS）——具有趋化因子样特性，能够刺激淋巴细胞、活化的单核细胞和未成熟的树突状细胞(8). 由于其他与抗合成酶综合征无关的tRNA合成酶（通过自身抗体）未能表现出类似的趋化因子特征，这些研究进一步表明，先天性免疫途径可直接促进抗原性和疾病发病机制。

为了研究组氨酸-tRNA合成酶（HRS，最常见的靶向tRNA合合酶）在触发先天性免疫反应导致肌炎临床表达中的作用，我们先前设计了一种基于肌肉内（IM）免疫的小鼠模型，在没有额外外源性佐剂的情况下使用重组HRS亚片段进行免疫(9). 在NOD和C57BL/6小鼠的各种同源菌株中，该实验系统产生了显著的IgG类开关自身抗体反应，以及直接归因于HRS（而非HRS融合蛋白的MBP部分）的强大的CD3+CD44+CCR5+肌肉淋巴细胞浸润。C3H/HeJ和DO11.10/Rag2组织表型的持续性−/−小鼠证明肌肉组织的细胞侵袭分别不依赖于Toll样受体4（TLR4）或T细胞受体（TCR）信号(9). 总之，这些观察结果表明，HRS能够诱导不依赖抗原特异性适应性免疫反应的肌炎，C3H/HeJ小鼠（在抗HRS抗体滴度显著降低的情况下发生红斑性肌炎）中抗HRS自身抗体形成和肌肉淋巴细胞侵袭的相对解耦进一步支持了这一结论。

鉴于HRS诱导的肌炎模型中涉及先天免疫信号的证据的重要性，我们设计了当前的研究来探索这种反应的机制基础。尽管先前在TLR4信号传导缺陷的C3H/HeJ小鼠中的实验表明TLR4不是肌炎发展所必需的，TLR信号级联在许多先天性免疫反应中的中心作用使我们使用一系列C57BL/6衍生的敲除菌株以及TLR转染细胞系来检查其他非TLR4途径的作用。总之，这些实验表明，结合优先结合的TLR配体，重组HRS通过几个MyD88依赖性受体介导重叠信号，介导该疾病模型中肌肉的细胞浸润。

方法

小鼠

迈阿密大学动物护理和使用委员会批准的免疫方案中使用了以下菌株的8至12周龄雄性和雌性小鼠：C57BL/6（B6），B6.MyD88−/−、B6.TLR2−/−、B6.TLR4−/−和B6.TLR2−/−.TLR4级−/−（两次击倒）。除B6.TLR2外，所有菌株均来自Jackson实验室（缅因州巴尔港）−/−.TLR4级−/−Ru Liu-Bryan博士（加州大学圣地亚哥分校）在杂交B6.TLR2后提供的小鼠−/−带B6.TLR4−/−老鼠。

重组蛋白

如前所述(10)mHRS的免疫优势氨基酸末端片段作为麦芽糖结合蛋白融合蛋白MA/MBP（mHRS与MBP羧基末端相连的氨基酸1-151）产生。使用类似的方法，我们生成了一系列额外的MBP融合蛋白，其中包含人类HRS（hHRS）的氨基末端亚片段，命名为HA5/MBP（aa 1–151）、HA4/MBP（aa 1–120）、HA3/MBP（AA1–90）和HA2/MBP（ia1–60）。以类似的方式生产，70 kDa RNP/MBP由Eric Greidiger博士（迈阿密大学）提供。按照制造商的方案（新英格兰生物实验室，伊普斯威奇，马萨诸塞州），用直链淀粉树脂纯化细菌表达的融合蛋白，对PBS进行透析，并在体外刺激试验或小鼠肌肉免疫之前对过滤器进行消毒。凝胶纯化蛋白的制备需要通过SDS-PAGE（10%聚丙烯酰胺凝胶）进行分离，提取凝胶片段，并在透析和过滤器消毒之前进行电泳洗脱。通过鲎试剂（LAL）检测评估所有重组蛋白的内毒素活性（Lonza，Allendale，NJ）；根据制造商的方案（皮尔斯/赛默飞世尔科学公司，伊利诺伊州罗克福德），还使用聚赖氨酸亲和纯化柱去除所选蛋白质中的内毒素。

TLR信号的体外测量

通过隔夜体外刺激分别转染人类TLR2、小鼠TLR4或小鼠TLR5（加州圣地亚哥InvivoGen）的HEK293细胞，测试重组蛋白的TLR2、TLR4和TLR5信号传递能力。基于ELISA的培养上清液中IL-8生成的评估（根据制造商的方案）提供了相对TLR信号能力的定量测量。

免疫接种

实验小鼠接受肌肉注射可溶性、亲和纯化的MA/MBP蛋白质（4-5 mg/ml）或人类HRS氨基末端亚片段（HA2-HA5/MBP，2.5-3 mg/ml），注射到两条腘绳肌，总体积为100µl（50µl/侧）。然后处死小鼠，在第17天采集血清、淋巴组织和肌肉，这是该模型中肌炎发展的既定终点(9).

组织病理学和免疫组织化学

采集的器官在石蜡包埋、切片和苏木精/伊红染色之前，由迈阿密大学病理学实验室部门用10%福尔马林固定。在这些染色程序之后，一位具有肌肉病理学专门知识的神经肌肉研究人员独立地对肌肉组织的炎症严重程度进行了评分/确认（同时对研究组进行了盲检）。基于高倍放大下多个视野中淋巴细胞浸润的相对面积和强度的评分范围为0-3，其中0=无炎症，1=轻微，2=中度，3=严重炎症。

为了对细胞浸润进行免疫组织化学评估，根据匹兹堡大学移植免疫组织病理学核心实验室制定的方案，用一系列针对不同分子标记物的抗体对去甲胎肌肉标本的组织切片进行染色。这些抗体包括抗CD3（A0452；Dako North America，Carpenteria，CA）以及抗TLR2（ab24192）、抗TLR4（ab13556）、抗CD11c（ab33483-N418）和抗B220/CD45（ab10558）（后者的抗体均来自马萨诸塞州坎布里奇的Abcam）。

酶联免疫吸附试验

在用各种形式的重组HRS免疫的小鼠的血清中，根据先前制定的方案，使用标准固相ELISA测定IgG抗鼠抗体或人HRS抗体的水平(10). 底物抗原包括重组hHRS（全长人HRS，1.0µg/ml）、重组mHRS（长鼠HRS，1.0ug/ml）或重组MBP（麦芽糖结合蛋白，1.0ugg/ml）。

LPS-HRS和FSL-1-HRS复合物形成的测定

为了评估HRS-LPS和HRS-FSL-1复合物的形成，我们将不同浓度的LPS（菌株0111:B4，Sigma-Aldrich，St.Louis，MO）或TLR2配体FSL-1（InvivoGen，San Diego，CA）与亲和力纯化的杆状病毒表达的HRS（全长）预培养持续两小时，然后将这些混合物添加到预先用1%牛血清白蛋白在PBS/0.05%吐温-20中封闭的ELISA微孔中，再增加两小时。随后用PBS/Tween冲洗平板，用抗人HRS小鼠血清（1:1000稀释）进行探测，然后用PBS/Tween重新冲洗。用辣根过氧化物酶缀合的抗小鼠IgG二级抗体（0.04 mg/ml，Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA）和3，3，5，5-四甲基联苯胺（TMB）底物（Sigma Aldrich，St.Louis，MO）连续孵育后，用1N H终止酶促反应2SO公司4并使用分光光度法测量的OD进行量化450值。作为一种补充方法，预先结合的底物抗原（全长HRS（杆状病毒表达）、卵清蛋白）与生物素化LPS（Invivogen，San Diego，CA）共同孵育，然后用链霉亲和素-辣根过氧化物酶结合物（R&D Systems，Minneapolis，MN）进行探测在上述酶促显色程序之前。

HRS-HMGB1结合检测

在改进的ELISA格式中，将不同浓度的杆状病毒表达的重组人HRS（hHRS）或小鼠HRS（mHRS）（范围为0.1–10µg/ml）添加到涂有重组人HMGB1（加州圣地亚哥eBioscience）的96孔板中2小时。在用PBS/0.05%吐温-20多次洗涤后，根据既定方案，通过连续应用先前生成的鼠或人HRS特异性小鼠血清（1:1000稀释）和HRP-结合抗鼠IgG二级抗体（1:10000稀释，德克萨斯州达拉斯圣克鲁斯生物技术公司），检测到HRS-HMGB1复合物(10).

统计学

使用Mann-Whitney比较肌肉炎症的严重程度评分U型-经检验，显著性基于双尾p值<0.05。相对抗HRS抗体水平（以调整后的OD表示450值）也通过Mann-Whitney U检验和双尾p值阈值<0.05进行评估，以获得统计显著性。

结果

肌肉HRS免疫后MyD88基因敲除小鼠不能发展为肌炎

为了确定MyD88依赖性信号通路在HRS诱导的肌炎中的潜在作用，我们免疫了B6.MyD88−/−通过肌肉注射将MA/MBP（小鼠HRS的氨基末端片段（氨基酸1-151）融合到麦芽糖结合蛋白）小鼠（n=10）。如所示图1，尽管持续存在显著的抗HRS自身抗体反应，但在缺乏MyD88信号的情况下，MA/MBP免疫未能诱导肌炎。这些结果再次证明了HRS免疫触发的体液免疫和细胞免疫反应的相对解耦，并进一步支持了先天免疫信号在驱动该模型系统的组织表型中的主导作用。

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B6.MyD88的MA/MBP免疫−/−小鼠未能诱发肌炎

A） 显微照片（400倍放大）显示了来自B6.MyD88的肌肉组织的代表性苏木精和伊红染色切片−/−（MyD88−/−)和C57BL/6小鼠肌肉注射MA/MBP（小鼠HRS的氨基酸末端151氨基酸与麦芽糖结合蛋白（MBP）融合）后17天。随附的条形图显示了n=10 B6.MyD88肌肉炎症的平均严重程度得分−/−n=10只C57BL/6小鼠，误差条代表SEM。B）IgG抗鼠HRS抗体的相对滴度显示在该点图中，其中单个数据点代表基于ELISA的调整OD测量450值（OD450mHRS（1µg/ml）-外径450无抗原）使用从n=10 B6.MyD88中获得的第17天血清（1:1000稀释）−/−n=10只C57BL/6小鼠。水平条表示平均外径450每个应变的值。

重组HRS通过多个MyD88依赖性Toll样受体引导信号

虽然MyD88有助于TLR和非TLR信号级联，但B6.MyD88的肌炎表型消失−/−小鼠强烈提示在MA/MBP免疫后MyD88依赖性TLR信号的作用。作为HRS介导TLR信号的替代测量，我们评估了MA/MBP和各种控制蛋白刺激转染不同细胞外膜结合、MyD88依赖性TLR（包括TLR2、TLR4和TLR5）的HEK293细胞的能力。图2A明确证明MA/MBP可以通过TLR2和TLR4驱动信号，但不能通过TLR5。该活性对MA/MBP和相关重组HRS融合蛋白具有相对特异性，远远超过无关融合蛋白（70kDa RNP/MBP）或MBP单独促进的刺激。

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TLR转染HEK293细胞的体外刺激

A） 条形图描述了各种重组蛋白与表达所示细胞表面Toll样受体（TLR）的HEK293细胞通宵共孵育产生的相对IL-8生成量（pg/ml，通过ELISA测定）。为了便于解释，从单个蛋白质诱导的值中减去了未刺激TLR转染细胞（TLR2=44 pg/ml、TLR4=232 pg/ml和TLR5=226 pg/ml）IL-8分泌的背景水平。蛋白质浓度范围为0.5µg/ml（TLR4和TLR5刺激）至3.0µg/ml（TLR2刺激），其中MBP=麦芽糖结合蛋白，MA/MBP=小鼠HRS与MBP融合的氨基酸1-151，以及U1RNP复合物与MBP的70 kDa/MBP=70kDa组分。鞭毛蛋白（100 ng/ml）作为刺激TLR5转染的HEK293细胞的阳性对照。误差条代表SEM值。B） 这些曲线图说明了TLR2-和TLR4-转染的HEK293细胞在以面板A中指定的浓度使用经过滤器消毒和凝胶纯化的重组MA/MBP（MA vs.MA gp）刺激后的相对IL-8生成量（pg/ml）。误差条再次表示SEM值。面板A和B中描述的所有分析都代表了至少两个独立实验。

在TLR4的情况下，HRS融合蛋白的刺激活性与鲎试剂（LAL）分析的结果相似，后者表明相对于替代的细菌产生的融合蛋白，内毒素与HRS构建体的结合显著一致增强(补充图1). 支持这些发现的是，LPS与真核表达系统中产生的更纯化形式的HRS共同孵育产生了明显的证据，证明通过TLR4能够增强结合和复合形成协同/加性信号(补充图2). 有趣的是，凝胶纯化显著降低了细菌表达的HRS衍生物MA/MBP通过TLR4发出信号的能力(图2B和补充图1)，对该HRS融合蛋白通过TLR2发出信号的能力影响较小(图2B)-表明TLR2结合/激活源于该重组抗原对外源TLR2配体的更高亲和力。体外实验证实了重组HRS结合TLR2配体FSL-1并协同激活TLR2转染的HEK293细胞的能力(补充图3).

HRS在B6.TLR4中诱导肌炎−/−和B6.TLR2−/−老鼠

基于这些体外信号检测结果以及免疫组织化学研究，证明TLR2和TLR4在肌肉细胞浸润中的表达(图3)，我们评估了MA/MBP在B6.TLR4中诱导肌炎的能力−/−和B6.TLR2−/−老鼠。TLR4信号缺失C3H/HeJ小鼠的重复发现(9)B6.TLR4的MA/MBP免疫−/−小鼠容易诱发肌肉炎症，与C57BL/6 WT小鼠产生的炎症相似(图4A). 然而，出乎意料的是，B6.TLR2的平行免疫−/−MA/MBP小鼠也会引发严重的肌炎以及高滴度的IgG类开关抗HRS自身抗体(图4B和4C). 综上所述，这些发现提高了通过TLR2和TLR4定向的冗余信号级联的可能性，而非涉及无关的MyD88依赖性通路。

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肌肉细胞浸润中TLR2和TLR4表达的免疫组织化学分析

显微照片（400x）显示来自MA/MBP免疫C57BL/6小鼠的脱蛋白肌肉组织的免疫组织化学染色。标签表明使用了针对CD3、CD45/B220、CD11c、TLR2和TLR4的抗体。为了便于说明，省略了相应的同型控制。

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MA/MBP免疫诱导TLR2-和TLR4-缺陷小鼠肌炎

A） 显微照片（左栏100倍，右栏400倍）显示了在用MA/MBP对指示菌株进行肌肉免疫17天后获得的具有代表性的苏木精和伊红染色肌肉组织。B） 随附的条形图描绘了n=10 B6.TLR2的肌肉炎症的平均严重程度评分−/−（TLR2−/−)，n=15 C57BL/6，n=5 B6.TLR4−/−（TLR4−/−)小鼠；误差条反映SEM。C）点图显示了基于ELISA的对从A组所列小鼠获得的第17天血清（1:1000稀释）中IgG抗mHRS水平的评估。而单个数据点表示调整后的OD450值（OD450mHRS（1µg/ml）-外径450无抗原），水平条表示平均OD450获得指定小鼠品系的读数。

同时消除TLR2和TLR4信号损害HRS诱导的肌炎

为了更好地满足该系统中TLR2和/或TLR4信号的需求，我们接下来免疫了B6.TLR2−/−.TLR4级−/−重组HRS的双敲除小鼠图4和图5与C57BL/6 WT或单一TLR基因敲除小鼠相比，这些双敲除小鼠在MA/MBP免疫应答中的肌肉炎症明显减轻（平均严重度得分+/-SEM:C57BL/6=1.83+/-0.17；B6.TLR2−/−=2.15 +/- 0.15; B6.TLR4号机组−/−=1.7 +/- 0.12; B6.TLR2号机组−/−.TLR4级−/−=0.72 +/- 0.17). 尽管这些结果与TLR2和TLR4信号通路在肌炎发展中的主要作用一致，但轻度残留肌肉炎症和低水平抗HRS抗体滴度的持续存在表明，其他次要HRS介导的信号通路在该模型中可能起作用。

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MA/MBP诱导的肌肉炎症在B6.TLR2中显著减少−/−.TLR4级−/−双基因敲除小鼠

A） 显微照片（100x左柱，400x右柱）显示了从B6.TLR2获得的具有代表性的苏木精和伊红染色肌肉组织切片−/−.TLR4级−/−（TLR2/TLR4-DKO）和WT C57BL/6小鼠在用MA/MBP肌肉内免疫后17天。B） 在n=9 B6.TLR2中观察到的肌肉炎症的平均严重程度得分−/−.TLR4级−/−n=15只C57BL/6小鼠如随附条形图所示。C） MA/MBP免疫B6.TLR2的相对IgG抗mHRS抗体滴度−/−.TLR4级−/−（n=9）和C57BL/6（n=15）小鼠在该点图中进行了描述，其中单个数据点表示调整后的OD450使用1:1000血清稀释液和1µg/ml底物抗原浓度获得的值。水平条表示总体平均OD450值。

HRS亚片段分析确定了一个负责介导TLR信号传导和肌炎诱导的关键区域

鉴于MA/MBP能够产生TLR2-和TLR4-介导的信号，从而促进C57BL/6-衍生菌株肌炎的发展，我们试图确定负责这些生物效应的HRS区域。对先前从MA/MBP的人类同源物HA5/MBP中构建的亚片段的体外评估表明，HRS中跨越氨基酸60-90的片段对于刺激TLR2-和TLR4-转染的HEK293细胞产生IL-8至关重要(图6A). 对HRS亚片段的LAL评估结果与TLR4转染的293细胞的结果相一致，显示在缺乏60-90氨基酸的情况下内毒素活性显著降低（数据未显示）。与这些体外研究相对应，MBP融合到亚片段HA2（aa 1-60）、HA3（aa 1-90）、HA4（aa 1-120）或HA5（aa 1–151）的C57BL/6小鼠免疫表明，截断氨基酸60–90可以消除HRS诱导的肌炎(图6B)以及自身抗体的形成(图6C).

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人类HRS的氨基末端亚片段通过TLR2和TLR4产生与肌炎诱导相关的可变信号

A） 与MBP融合的人HRS（hHRS）亚片段差异刺激用TLR2或TLR4转染的HEK293细胞，导致不同水平的IL-8产生（pg/ml，y轴）。在0.5µg/ml（TLR4刺激）到3.0µg/ml（TLR2刺激）的浓度范围内使用的蛋白质包括HA2/MBP=氨基酸1–60 hHRS/MBP、HA3/MBP=氨基酸1–90 hHRS/MBP、HA4/MBP=胺基酸1–120 HRS/MBP和HA5/MBP=氨基酸1-151 hHRS/MBP。图表代表了至少两个独立的实验。B） 肌肉组织的光微间隙（100x）和相应的条形图反映了C57BL/6小鼠与指定的hHRS亚片段（HA2、HA3、HA4：n=5只小鼠/组；HA5：n=10只小鼠）肌肉内免疫诱导的肌肉炎症的相对严重程度。误差条代表SEM。C）该点图显示了通过肌肉免疫C57BL/6小鼠产生的抗人HRS抗体滴度，以及所示的氨基末端亚片段。单个数据点表示调整后的OD450值（OD450hHRS-外径450无抗原），使用1:1000血清稀释液和1µg/ml的底物抗原浓度获得。水平条反映平均OD450n=5个样本/免疫原的值。

这些免疫实验进一步表明氨基酸90–120的重要作用，因为HA3/MBP引发的疾病比HA4/MBP和HA5/MBP诱发的疾病轻(图6B). 对B6.TLR2的HA3/MBP免疫产生的组织表型进行更详细的分析−/−和B6.TLR2−/−.TLR4级−/−与具有相同TLR2/TLR4基因敲除特征的HA5/MBP免疫小鼠的残留肌肉炎症持续存在相比，小鼠肌炎几乎完全消失（数据未显示）。考虑到HA3/MBP诱导的TLR2和TLR4信号的相对保留(图6A)这些集体数据表明，在用HA4/MBP或HA5/MBP免疫的小鼠中，跨越氨基酸90-120的HRS区域需要激活额外的非TLR2/TLR4通路，从而导致肌炎表型。

讨论

通过体外和体内实验的结合，我们证明了重组HRS产生肌炎的能力依赖于涉及MyD88的信号通路。而HRS容易诱导B6.TLR2的肌肉炎症−/−和B6.TLR4−/−小鼠的肌炎表型在B6.TLR2中显著减弱−/−.TLR4级−/−双敲除小鼠支持这些MyD88依赖性TLR通路之间冗余信号的可能性。对重组人HRS亚片段的分析表明，由于HA2/MBP（hHRS氨基酸1–60）不能刺激TLR2或TLR4转染的HEK 293细胞，并且不能刺激C57BL/6小鼠的肌炎，因此绝对需要氨基酸60–90来调节这些效应（直接或通过TLR配体的二级结合）。

与这些表明多种MyD88依赖性通路在HRS诱导的肌炎中的作用的研究结果一致，最近涉及人类肌肉组织标本的研究表明，在多发性肌炎和皮肌炎中，一些TLR，包括TLR2和TLR4，由自侵袭细胞表达(11,12). 虽然浸润淋巴细胞的抗原特异性尚待确定，但这一独立观察表明，人类疾病还涉及先天免疫系统的激活和随后的细胞募集。在这种情况下，感染或其他“危险”信号会触发血管/细胞粘附分子以及能够与内源性或外源性配体相互作用的各种TLR的上调，包括与假定的自身抗原（如HRS）相关的TLR。作为这一过程的延伸，随后HRS特异性B细胞和T细胞的扩增将向抗合成酶综合征的适应性体液和细胞免疫反应特征过渡。最终需要鉴定人类肌肉组织浸润中表达相关TLR的细胞亚群，以充分证实该模型，尽管该系统中的免疫组织化学发现和自身抗体产生/疾病诱导的快速时间过程表明重组HRS和表达特异性MyD88依赖性TLR的效应淋巴细胞之间存在直接相互作用的可能性。支持这一范式的是，最近对实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）的研究表明，通过TLR2和TLR4直接激活致病性CD4+效应T细胞，其影响范围从T细胞极化到淋巴细胞增殖/扩增(13,14).

在侵袭人类肌肉组织的细胞表达的疾病相关TLR中（TLR2、TLR4和TLR9）(11,12)在我们的抗原诱导性肌炎模型中，TLR2和TLR4与重组HRS的相互作用最为显著。而TLR4引导介导类开关IgG抗HRS自身抗体产生的信号(15)，TLR2和TLR4在驱动肌炎表型的细胞成分中起关键作用。事实上，对人类HRS重组亚片段介导的疾病诱导的更详细分析表明TLR2可能是该系统最关键的组成部分。例如，尽管HA3/MBP（人类HRS的氨基酸1-90）能够通过TLR2和TLR4发出信号，但在B6.TLR2中未能诱导显著的肌炎−/−老鼠。有趣的是，HA3/MBP介导的TLR4信号无法“拯救”B6.TLR2中的肌炎表型−/−小鼠（观察结果与实验一致，实验表明单独用中等剂量LPS免疫C57BL/6小鼠不会产生肌肉炎症（数据未显示））与MA/MBP和HA5/MBP在缺乏功能性TLR2的情况下诱导相对严重疾病的能力形成鲜明对比(图4和数据未显示）。这些结果有效地说明了后者自身抗原通过选择性TLR/非TLR信号级联分流信号的能力，从而导致活动性肌炎。

除了B6.TLR2中的这些发现−/−小鼠，支持额外HRS介导的信号通路的存在来自于在C57BL/6 WT和B6.TLR2中进行的免疫实验−/−.TLR4级−/−双基因敲除小鼠。例如，在C57BL/6小鼠中，HA3/MBP产生的肌肉炎症明显少于HA4/MBP和HA5/MBP，尽管有证据表明通过TLR2-和TLR4-转染的HEK293细胞有相同的信号。补充了该观察结果，该观察结果支持HRS中氨基酸90–120的关键作用，B6.TLR2中残留（尽管明显减少）自身抗体生成和肌肉炎症的持续存在−/−.TLR4级−/−用MA/MBP或HA5/MBP免疫的双基因敲除小鼠表明，该系统中至少存在另一条信号通路。

MyD88依赖性肌炎诱导的其他候选物包括RAGE（高级糖基化终产物受体），一种能够结合配体HMGB1（高迁移率族框1）的多域受体(16). 有趣的是，我们在改进的ELISA系统中检测到HMGB1与真核生物HRS的结合(补充图4)-进一步证明HRS与关键MyD88相关信号通路激活剂物理偶联的能力。虽然需要更详细的分子评估来正式证明HMGB1（或这种报警素的细菌类似物）和HRS之间的相互作用，但以前的研究表明HMGB1在肌炎患者的肌肉组织中异常分布(17,18). 同样有趣的是，HMGB1能够通过TLR2和TLR4发出信号(18,19)，为我们的HRS诱导肌炎模型系统提供了另一个潜在的联系。

与这些概念一致，当前研究的结果明确表明，HRS具有独特的生物物理特性，使该分子能够直接或间接（通过结合额外的刺激分子）作为多种先天免疫信号通路的配体发挥作用。如TLR转染HEK293细胞的体外刺激所示(图2和未显示的数据），MA/MBP和HA5/MBP的凝胶纯化并没有均匀地降低这些重组蛋白产生TLR2介导的信号的能力，这表明这种特性可能是细菌产生的HRS所固有的。尽管通过TLR4发出信号的能力在很大程度上被凝胶纯化所消除，这些实验（结合内毒素活性的比较LAL分析）表明，外源性细菌衍生TLR4配体的潜在结合是一种非人工的、抗原特异性的特性，它严重依赖于人类HRS中氨基酸60-90所包含的蛋白质序列/结构。

结合人类炎症性肌病中与MyD88依赖性信号通路相关的累积免疫组织化学和RNA分析数据(11,12)这项工作的总体发现表明，HRS作为各种内源性/外源性配体的锚定蛋白（类似于LPS结合蛋白），能够协同驱动先天免疫反应。因此，阐明不同糖基化模式和其他有助于增强这些配体结合的结构特征的生物学相关性至关重要，但显然需要对真核表达系统中产生的平行HRS结构进行更详细的实验操作。

从更广泛的角度来看，我们的实验结果共同支持了这样一个概念，即HRS等自身抗原可能在桥接先天性和适应性免疫反应方面发挥重要作用，而这些免疫反应是启动和/或维持肌炎等自身炎性过程所必需的。尽管免疫原性和疾病发病机制的具体机制可能不同，但这一框架与新出现的数据完全一致，这些数据强调了先天免疫激活在从类风湿性关节炎到系统性红斑狼疮和多发性硬化症等其他自身免疫性疾病中的主要作用（综述于(20–26))-每一种都得到了严重依赖先天免疫信号级联的动物模型的支持（例如胶原蛋白诱导的关节炎、原始诱导的狼疮和实验性自身免疫性脑脊髓炎(27)). 与肌炎更相关的是，先前的研究表明坏死细胞碎片和来源于Jo-1抗体阳性患者的血清可以通过胞内TLR启动信号传递（导致浆细胞样树突状细胞产生IFNα），这进一步支持了联合免疫激活的范式(28). 在目前的模型中，磁共振成像研究（未显示）证明了远离HRS/IFA接种部位的肌肉群中的水肿/炎症，也提供了局部诱导的先天免疫反应和更多全身参与之间相互作用的体内证据。

除了这些将先天性和适应性免疫反应与HRS联系起来的观察结果外，肌肉组织自身TLR2和TLR4的表达(18,29–31)强调了我们模型的相关性，并表明HRS或其他相关TLR激动剂可能直接激活MyD88依赖性信号级联，从而改变NFκB介导的基因表达谱，最终导致肌肉功能障碍。最终，确定人类疾病中的这些相互作用对于开发替代性、分子靶向治疗方法至关重要，因为这些方法缺乏更多全球免疫抑制的副作用。

补充材料

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致谢

作者对本文的内容承担全部责任，这些内容不代表退伍军人事务部或美国政府的观点。

缩写

国际货币基金组织特发性炎性肌病
颗粒物多发性肌炎
DM公司皮肌炎
高分辨率分光计组氨酸-tRNA合成酶
MA/MBP公司小鼠Jo-1与MBP融合的151个氨基酸末端片段
MBP公司麦芽糖结合蛋白
TLR公司类Toll受体
液化石油气脂多糖

脚注

基金：

Dana P.Ascherman：NIH R21 AR056279

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