简介
癌细胞的一个主要特征是其无限增殖的能力，部分原因是端粒长度的维持。大多数人类肿瘤通过激活端粒酶来维持端粒，但在较小的肿瘤亚群中，端粒酶的缺失通过一种称为端粒选择性延长（ALT）的重组机制来维持端粒酶。ALT的表型特征是端粒长且不均一，存在ALT相关的早幼粒细胞白血病小体（APB），APB包含端粒DNA、端粒结合蛋白TRF1和TRF2，以及与DNA重组和复制有关的蛋白质，包括MRN复合蛋白MRE11、RAD51和NBS(Henson，Neumann等人，2002年;Yeager，Neumann等人，1999年). 这些蛋白与ALT表型的关联使其作为ALT的潜在标记物或调节器具有吸引力(Jiang，Zhong等人，2007); 事实上，MRN复合物是ALT细胞中APB形成和端粒维持所必需的(Zhong，Jiang等人，2007年).
虽然ALT在肿瘤中的总体患病率相对较低，但在间质起源的肿瘤中观察到的发病率较高。然而，即使在这一组中，ALT的患病率也各不相同。77%的恶性纤维组织细胞瘤(Henson、Hannay等人，2005年)骨肉瘤占47%-66%(Henson、Hannay等人，2005年;Ulaner，Huang等人，2003年)ALT阳性，而25%的多形性胶质母细胞瘤(Hakin-Smith、Jellinek等人，2003年)和脂肪肉瘤(Costa、Daidone等人，2006年;Johnson，Varkonyi等人，2005年)没有Ewings肉瘤(Ulaner，Hoffman等人，2004年)由于ALT的预后意义不同，表明多形性胶质母细胞瘤患者预后良好，而脂肪肉瘤患者预后较差(Cairney，Hoare等人，2008年;Costa、Daidone等人，2006年)，了解调节ALT永生化和起源细胞的分子细节可能会影响这些恶性肿瘤的未来诊断或治疗。
间充质恶性肿瘤中ALT流行的一个可能解释是，与上皮来源的组织相比，间充质组织中的端粒酶基因受到更严格的抑制(Henson，Neumann等人，2002年). 我们以前报道过，在ALT细胞系中，hTR和hTERT都在染色质水平上受到积极抑制(Atkinson，Hoare等人，2005年)这表明端粒酶的强制抑制是促进ALT永生的一种潜在分子机制。然而，其他基因和信号网络也调节端粒酶，可能有助于选择ALT还是端粒酶。在本研究中，我们研究了端粒酶阳性细胞系、ALT细胞系和脂肪肉瘤组织样本的基因表达谱，以更好地了解调节端粒酶或ALT激活决定的分子机制。此外，我们还显示了间充质肿瘤与人类间充质干细胞（hMSC）之间的联系作为ALT永生化转化的靶细胞。
材料和方法
细胞系和RNA提取
使用的ALT细胞系为：SKLU（肺腺癌）、SUSM1（肝成纤维细胞）、KMST6（肺成纤维细胞，WI38-SV40（SV40永生化肺成纤维，SAOS）和U2OS（骨肉瘤）。使用的端粒酶阳性细胞为：C33a（宫颈癌）、HT1080（纤维肉瘤）、A2780（卵巢癌）和5637（膀胱癌）。使用的正常细胞株为WI38（正常肺成纤维细胞）和IMR90（正常肺纤维细胞）。如前所述分离骨髓hMSC(Serakinci，Hoare等人，2006年)并在5%CO的DMEM-LG和谷氨酰胺中培养，补充17%的Hyclone FBS（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA）2
按照制造商的说明，使用Nucleospin II RNA提取试剂盒（德国杜伦市Macherey-Nagel）提取RNA。
脂肪肉瘤病例与RNA提取
来自先前描述的较大研究人群的17例脂肪肉瘤样本子集（9例ALT和8例端粒酶阳性）(Cairney，Hoare等人，2008年)用于基因表达分析。
使用Hybaid Ribolyser在5.5的设置下破坏冷冻组织，持续5×10秒脉冲，中间停顿30秒，并根据制造商的说明使用RNeasy脂质试剂盒（Qiagen Inc，Hilden，Germany）提取RNA。
基因表达微阵列杂交、标准化和质量控制
用基因表达芯片检测4株ALT细胞（WI38-SV40、KMST6、SKLU、SUSM1）和4株端粒酶阳性细胞（A2780、C33a、HT1080、5637）、2例正常成纤维细胞（WI38、IMR90）、4例hMSCs和17例脂肪肉瘤标本。按照制造商的说明，使用安捷伦低RNA输入线性扩增试剂盒PLUS（单色）扩增并标记每个样品的两个单独RNA样品，并与安捷伦全人类基因组4×44K基因表达阵列杂交。使用安捷伦特征提取软件（安捷伦科技，加州圣克拉拉）从扫描图像中提取原始数据。
然后将所有阵列数据导入GeneSpring GX（版本7.3.1，安捷伦科技，加州圣克拉拉），并将其归一化为50第个，对于细胞线阵列，或70第个hMSC和脂肪肉瘤阵列的百分比，以确保所有样本的中位数相等。进一步的质量控制包括基于标记值的筛选，在下游分析中只包括那些至少一半样本具有非缺失标记值的基因。结果基因组分布的方框图()使用Minitab版本14绘制，以评估各组的可比性。提交给GEO供公众访问的数据文件，注册号为{“类型”：“entrez-geo”，“属性”：{“文本”：“GSE14533”，“term_id”：“14533”}}第14533页.
统计分析、特征生成和聚类
所有统计分析和签名生成均在GeneSpring GX中进行。使用WELCH ANOVA（错误发现率为0.05）和Benjamini和Hochberg多重测试校正，从细胞系表达谱中生成1305个基因签名。在脂肪肉瘤样本中进行的类似分析没有产生任何结果，因此，为了生成精确的297个基因签名，使用脂肪肉癌表达谱进行了Fishers精确测试，使用p值≤0.05来测试基因表达与端粒维持机制的显着关联。从这一分析中，1305个特征中也存在422个基因。这些基因在细胞系和脂肪肉瘤数据中具有相同方向的折叠变化值（即与端粒酶阳性相比，ALT的表达增加或减少），这些基因被包括在改进的签名中。
所有层次聚类均使用Spearman相关性、平均连锁和相似性相关性小于等于0.001的合并分支进行。
微阵列数据的Q-PCR验证
使用DyNAmo Hot star SYBR Green试剂盒（芬兰埃斯波Finnzymes）和MJ Research的Option 2 DNA引擎，通过定量PCR验证了1305签名中的一些基因表达。QPCR验证的引物序列如下：MYEOVF:5′-TGGGAGGACACGCAAGCATT，MYEOVR:5′-CACAGCAGAAGAAAG，WNT5BF:5′-AGGAGGTTGGTGTTTT，WNT5AR:5′-GAACCTGGAGAAGAG，DSC54F:5’-ACCTTCTTAGAAATGA，DSC54 R:5’-ACTGCTTATTCCAT，NSUN5F:5'-TGAGACCACCAGCAG，NSUN5 R:5'-GAGGAGAGAGAGCATCTC。
将每个基因的表达标准化为GAPDH作为负载对照：GAPDHF:5′ACCACAGTCCATGCCATCAC，GAPDHR:5′TCCACCACCCTCGTCCATGGTA。
Metacore中的网络分析
来自297个基因签名的表达数据被转换为ALT相对于端粒酶阳性的倍数变化，并上传到Metacore分析套件（Genego Inc，St Joseph，MI）。使用软件中的分析网络算法进行网络分析。
网络分析的Western印迹验证
使用NuPAGE MES运行缓冲液（英国伦弗鲁什郡英维特罗根）在10%Bis-Tris凝胶上分离15微克蛋白质当量，然后将其印在硝化纤维素膜上（英国沃特福德郡米利波），并将其封闭在含有5%脱脂奶粉的PBS-Tween 20中。分别用以下抗体探测膜：HDAC5兔多克隆（CONC）（Active Motif，Rixenstart，Belgium）PKCα-兔多克隆和KAT2A/GCN5兔多克隆（CONC）（Abcam，Cambridge，UK）和二级抗-rabbit IgG HRP-linked抗体（New England Biolabs UK，Hitchin，UG）。在可视化后，将结合的一级和二级抗体浸泡在1%十二烷基硫酸钠和0.2M甘氨酸（pH2.5）中，并在室温下摇晃1小时，在用负载控制抗体ERK1兔多克隆（1:3000）进行检测之前，将其去除，然后重新锁紧（德国海德堡圣克鲁斯生物技术公司）。
c-MYC DNA结合ELISA
核提取物约为8×108根据制造商的说明，使用活性基序核提取试剂盒一式三份提取6个ALT细胞系（WI38-SV40、KMST6、SKLU、SUSM1、SAOS、U2OS）和4个端粒酶阳性细胞系（A2780、C33a、HT1080、5637）中的每一个的细胞。c-MYC DNA结合ELISA（Active Motif，Rixenstart，Belgium）根据制造商的指示分三次进行，每个细胞系有四个技术复制品。在每次分析中运行5、2.5、1.25和0.625 ng/孔重组c-MYC蛋白（比利时里克森斯塔特的Active Motif）的标准曲线，以便进行相对定量。对所有ALT和端粒酶阳性细胞的结果进行分组，并在Minitab（版本14）中进行T试验。
结果
基因表达分析区分端粒酶和ALT细胞系
我们最初通过使用安捷伦全人类基因组单色微阵列生成4个ALT和4个端粒酶阳性细胞系的表达谱来研究端粒维持机制（TMM）特异性基因表达特征的存在。在材料和方法中可以找到质量控制措施和应用的归一化选项的详细描述，但箱线图显示归一化数据在两组之间分布均匀且具有可比性()ALT和端粒酶阳性细胞系组的中位数几乎相等，分别为0.78和0.79。
为了探讨这些大样本中单个基因的表达是否与端粒酶阳性或ALT细胞的定义有关，我们进行了Welch方差分析，以寻找两组之间基因表达的显著差异(，左侧面板）。生成了1307个探针的列表，对应于1305个p值≤0.05的差异表达基因。关注较大的1305基因标记中单个基因的表达值，很明显，在ALT细胞系中表达较高的地方，端粒酶阳性细胞系和反之亦然(). 此外，基于该特征的细胞株的分层聚类准确地将ALT和端粒酶阳性细胞株分为两个单独的组()这表明，负责定义端粒酶或ALT的基因或参与调节TMM激活决定的基因可能位于该特征中。
基因表达谱分析区分端粒酶阳性细胞系和ALT细胞系，提示ALT起源于间充质干细胞。
（a） 散点图表示ALT（蓝色）和端粒酶阳性（红色）细胞系中1305基因特征的归一化微阵列表达值相对于总体中位表达值。每个点代表一个基因的平均基因表达值，而误差条代表标准误差。
（b） 使用Spearman相关性、平均连锁和相似性相关性为0.001或更低的合并分支对细胞系数据进行分层聚类，使用1305签名准确地将端粒酶阳性（红色）细胞系与ALT（蓝色）细胞系分开。
（c） 端粒酶阳性（红色）和ALT（蓝色）细胞系、正常成纤维细胞（紫色）和hMSC（绿色）采用Spearman相关性、平均连锁和合并分支进行分层聚类，相似性相关性为0.001或更低，具有1305基因特征。
使用1305基因标记的聚类提示ALT起源于间充质干细胞
ALT主要存在于间充质来源的肿瘤中，这一事实促使我们研究ALT是否是转化细胞的一种功能，以及间充质干细胞是否可能是ALT肿瘤的潜在来源细胞。我们使用1305基因特征进行了分层聚类分析，以研究端粒酶阳性、ALT和正常成纤维细胞系与hMSC之间的关系(). 该标记准确地分离出端粒酶阳性细胞、ALT细胞系、正常成纤维细胞和hMSC。然而，当端粒酶阳性细胞系聚集在一个单独的分支上时，ALT细胞系、正常成纤维细胞和hMSC都聚集在一起。与ALT相比，正常成纤维细胞与hMSC更直接相关，但成纤维细胞和hMSC与ALT细胞系同样相关，提示ALT来源于间充质干细胞。这可能正如预测的那样，但据我们所知，这是间充质细胞与ALT之间首次出现任何关联。
对特征的分析表明，端粒酶阳性和ALT细胞系之间存在与干细胞维持和自我更新过程相关的几个基因的差异表达。选择其中四个表达差异较大的基因进行定量PCR验证(). 其中三种在ALT细胞系中显著上调，在端粒酶阳性细胞中几乎不表达。DSC54是一种新的间充质干细胞蛋白，目前对其研究较少；WNT5b是一种众所周知的干细胞功能调节因子，与肿瘤的发生和发展有关；MYEOV在骨髓瘤中过度表达，并在促进侵袭和增殖中发挥作用。最后一个基因NSUN5是一种增殖相关的核仁抗原，其缺失可能导致发育障碍威廉姆斯综合征的早衰效应。与ALT细胞系相比，NSUN5在端粒酶阳性中显著上调。
1305基因表达特征的验证突出了干细胞的联系。
（a） 通过定量PCR验证DSC54、WNT5B、MYEOV和NSUN5在端粒酶阳性细胞系5637、A2780、C33a和HT1080（黑条）以及ALT细胞系WI38-SV40、KMST6、SKLU、SUSM1（灰条）细胞系中的表达水平。每个条形代表根据GAPDH标准化的代表性实验中三次反应的平均值和标准误差。
（b） 从公开的微阵列表达数据中提取的各种正常组织中DSC54、WNT5B和MYEOV的表达值，与ALT和端粒酶阳性细胞系和hMSC的表达值进行比较。点表示中值，而误差条表示最大和最小的标准化表达式值。
为了进一步探讨ALT和间充质干细胞之间的联系，我们检测了这些基因在不同胚胎来源的各种正常组织和人类间充质细胞（hMSC）中的表达。从NCBI GEO数据库下载了来自正常成纤维细胞、平滑肌、基质、外上皮、上皮和内皮组织的公开可用基因表达谱，并将这些组织中DSC54、WNT5b和MYEOV的表达与hMSC、端粒酶阳性和ALT细胞系进行了比较(). 没有可用于NSUN5的可比数据，因此该基因不能包括在分析中。
与Q-PCR验证一致，ALT中所有3个基因的表达均高于端粒酶阳性细胞系。当比较所有的表达模式时，DSC54仅在ALT细胞系和hMSC中高，这与ALT的间充质干细胞来源一致。另一方面，WNT5b在不同组织类型和细胞系中的表达不同，hMSC表达最高，ALT和间质衍生组织，端粒酶阳性组织和上皮组织最低表达。MYEOV将ALT与端粒酶阳性细胞系区分开来，但在其他各种组织类型中也可以看到类似的低表达水平。
利用脂肪肉瘤基因表达对1305基因特征进行优化，可提高ALT和端粒酶阳性脂肪肉癌的分离，并提示在这种间叶性恶性肿瘤中ALT来源于间叶干细胞
脂肪肉瘤是间叶起源的肿瘤。为了利用原发性肿瘤的数据完善细胞系衍生特征，我们研究了1305基因表达特征在脂肪肉瘤中区分端粒酶阳性和ALT的能力。对17例先前特征化的脂肪肉瘤样本进行基因表达谱分析，其中9例为ALT，8例为端粒酶阳性。无监督聚类显示，样本中存在一些分裂，这取决于它们的TMM，当应用1305基因签名时，这种分裂没有得到改善。此外，hMSC不与任何脂肪肉瘤样本聚集在一起，而是聚集在一个单独的分支上(比较a和b）。
ALT和端粒酶阳性脂肪肉瘤样本以及hMSC的分层聚类将端粒酶阳性与ALT区分开来，并突出了ALT的hMSC起源。
脂肉瘤样本先前通过经典方法被确定为ALT（蓝色）或端粒酶阳性（红色）。使用Spearman相关性、平均连锁和合并分支对这些样本和hMSC（绿色）进行分层聚类，相似性相关性为0.001或更低，使用（a）所有基因（b）1305基因签名或（c）改进的297基因签名。
（d） 297个基因特征的网络分析显示hTERT调控。
使用Metacore中的分析网络构建算法绘制的297个基因签名中已知基因间直接交互的信号传递网络。绿色箭头表示正向、红色负向和灰色未指定交互。网络对象旁边的红色和蓝色圆圈表示表达式数据。红色：ALT升高，端粒酶阳性脂肪肉瘤样品和细胞株降低；蓝色：ALT降低，端粒酶阳性脂肪肉瘤样品和细胞系升高。该网络强调，c-Myc激活的一些分子降低了ALT细胞中的表达，而c-Myc抑制的分子则增加了ALT的表达。这表明使用ALT后细胞中c-Myc活性降低。
虽然1305的特征并没有改善聚集性，但脂肪肉瘤样本在很大程度上是根据端粒维持机制聚集在一起的。聚类图中ALT和端粒酶阳性肿瘤之间的明显分离使我们相信，尽管没有发现显著差异，但这两组之间的基因表达存在差异。为了进一步探讨这一点，我们使用Fisher精确测试来测试基因表达水平和端粒维持机制之间的任何关联。从该分析中，在ALT和端粒酶阳性脂肪肉瘤样本中，发现8227个探针对应6719个基因与TMM显著相关(右侧面板）。
为了进一步完善这一大特征，我们寻找与之前从细胞系测定的1305基因特征的任何重叠。在这1305个基因中，422个基因也存在于脂肪肉瘤标志物中，因此与脂肪肉癌和细胞系中的端粒维持机制有显著关联。通过与细胞系数据相比较，观察端粒酶阳性和ALT肿瘤中基因表达的方向，进一步完善了签名。422个基因中有297个基因表达与细胞系数据相当，其中152个基因在ALT中表达上调，在端粒酶阳性中表达下调，145个基因表达下调，在端粒酶阳性中上调(中央面板）。
使用这一精炼的297个基因标记对ALT和端粒酶阳性脂肪肉瘤样本进行分级聚类，结果表明两组之间存在明显的分离，除了2个ALT样本外，其余所有样本都聚集在一个分支上，而所有端粒酶呈阳性的样本都聚集到一个单独的分支上(). 此外，与细胞系数据中ALT的间充质干细胞来源假设一致，hMSC与ALT脂肪肉瘤聚集在一起，使用这种精细的标记，而不是在应用1305标记时作为一个单独的组(比较b和c）。
为了进一步验证改进后的签名，我们将其应用到细胞系数据中进行分层聚类。正如预测的那样，它准确地将端粒酶阳性从ALT细胞系中分离出来（数据未显示），进一步验证了这种改进后的签号是正确的，并且不会因减少基因数量而失去效力。
精炼的297基因签名参与端粒酶基因调控，并突显ALT中c-MYC活性较低
鉴于经改良的297个基因特征能够通过TMM分离脂肪肉瘤，我们假设特征中的基因可能包含与TMM相关的功能调节网络。为了探索这一点，我们使用GeneGo的Metacore进行了网络建模，使我们能够构建一个候选网络，指示从已发布数据中挖掘的297个特征中的基因之间可能的相互作用。该分析揭示了hTERT和端粒DNA的调控网络(). 来自297个基因签名的表达数据被转换为ALT在端粒酶阳性上的倍数变化，上传到Metacore分析套件并覆盖在直接相互作用网络上通过结合已知信号通路和实验确定的调节基因表达水平之间的相互作用，该方法可以预测ALT细胞中hTERT的调节和抑制。端粒酶阳性标本在ALT细胞和肿瘤中的hTERT表达降低。与此一致的是，已知的hTERT阻遏物E2F1在ALT样本中表达上调，而在基因激活中起作用的染色质修饰酶（如GCN5）在ALT中表达下调，这与乙酰化组蛋白关联减少和ALT细胞系中hTERT表达低一致，如我们之前所示。HDAC5 PKCa和GCN5的Western印迹显示在该网络中突出显示的表达差异也在蛋白质水平上可见。
TERT调节网络显示在蛋白质水平，预测的c-MYC活性在ALT中显著降低。
（a） Western blotting显示297基因网络中3个分子的蛋白质水平差异。15μg细胞提取物在NuPAGE 4-12%Bis-Tris凝胶上运行，转移到Millipore硝化纤维素膜上，并用适当的抗体进行检测。然后剥离印迹，并用ERK1负载控制重新进行处理。所示面板为2个单独螺栓的代表面板。
（b） c-Myc活性ELISA显示ALT细胞的活性显著降低。区间图显示了6个ALT细胞系（WI38-SV40、KMST6、SKLU、SUSM1、SAOS和U2OS）和4个端粒酶细胞系（A2780、C33a、HT1080和5637）的平均值，每个细胞系有4个重复。十字准线显示每组的平均表达，误差条显示平均值的95%置信区间。结果的T检验为T值=−2.51 P值=0.015 DF=51。
分析还表明c-Myc调控可能有助于签名。尽管c-Myc本身没有差异表达，但包括hTERT在内的21个特征基因被预测为c-Myc的转录靶点。有趣的是，预期被c-Myc激活的大多数特征基因被抑制，而那些预期被抑制的基因主要在ALT中相对于端粒酶阳性样品上调，这表明c-Myc活性可能在ALT被抑制。使用DNA结合活性ELISA对c-Myc活性水平进行的功能检测证实了事实确实如此，因为在ALT细胞系中发现c-Myc的活性水平显著降低（p=0.015），参见除hTERT外，另一个可能在端粒维持中发挥作用的下调c-Myc靶点是hnRPA3。最近的研究表明，hnRPA3在体外结合单链端粒重复序列，保护其免受核酸酶活性的影响，并通过端粒酶抑制其延伸(Huang，Tsai等人，2008年).
然而，重要的是，网络分析将我们对TERT调控的理解扩展到了先前公认的机制之外，扩展到了已知参与的上游新途径。总的来说，该网络强调了通过抑制hTERT来调节ALT表型的潜在机制，并为进一步扩展组织或肿瘤特定情况下的调节机制提供了平台，使我们能够了解生物过程的差异调节以及它们在不同情况下的差异肿瘤类型和正常组织。
讨论
目前对肿瘤发生过程中调节端粒酶或ALT激活决定的分子机制知之甚少。我们之前已经证明，端粒酶基因hTR和hTERT的缺乏表达与启动子处的染色质重塑有关，这表明这些基因的强制抑制可能导致细胞利用ALT机制实现永生(Atkinson，Hoare等人，2005年). 在本研究中，我们使用端粒酶和ALT细胞系以及脂肪肉瘤的基因表达谱来研究其他可能控制ALT表型的信号通路和网络，以及激活端粒酶或ALT以实现永生的决定。据我们所知，这是首次对端粒维持机制的全球基因调控进行研究。
我们在肿瘤细胞系中发现了一种基因表达特征，该特征能够通过层次聚类方法区分端粒酶阳性和ALT。利用脂肪肉瘤组织样本的基因表达谱进一步完善该特征，发现297个基因特征与TMM显著相关。虽然这些特征在ALT表型调控中的作用尚待充分研究，但通过结合临床样本和细胞株特征，我们已经揭示了一些潜在的生物学。对精炼特征中相互作用的网络分析强调了一个信号网络，该网络参与抑制ALT脂肪肉瘤样品和细胞系中的hTERT。对网络中3个分子的Western blot验证证实，这种模式也可以在蛋白质水平上观察到。与我们之前的工作一致(Atkinson，Hoare等人，2005年;Cairney，Hoare等人，2008年)这再次表明ALT中hTERT被强制抑制，并可能部分解释在分子水平上激活端粒酶或ALT的决定。虽然hTERT的表达不足以区分临床样本中的ALT和端粒酶阳性，但hTERT阻遏对ALT表型的调节显然很重要。这种相互作用网络也突显了使用ALT机制降低细胞c-Myc活性的潜力。通过使用c-Myc活性ELISA进行直接调查，证实ALT中c-Myc的活性水平较低。这与c-Myc是已知的hTERT转录激活物这一事实一致(Hao，Nancai等人，2008年)并且可能显示出进一步的机制，通过该机制激活ALT或端粒酶的决定受到影响。
这个候选网络进一步强调了基因表达全球分析的重要性。当一个基因的显著表达在某些情况下可能很重要时，如本例所示，更有可能是信号通路中基因组合的微小变化导致了表型的定义。通过在全球范围内研究信号网络，我们有更好的优势发现ALT表型的生物学基础及其在间叶性恶性肿瘤中的调节。
除了hTERT调节网络外，大量基因特征中还突出了一些干细胞相关基因。激活端粒酶或丙氨酸氨基转移酶的决定可能是在细胞水平上作出的，这是一个值得考虑的有趣假设。癌症生物学在许多方面与干细胞生物学相似，因为在癌症中调节干细胞自我更新表型和复制寿命的途径通常被解除。随着干细胞作为某些肿瘤起源细胞的兴趣日益浓厚，研究ALT永生的潜在来源可能会提高我们对端粒维持调控的理解。ALT在间叶恶性肿瘤中的优势促使我们研究人类间叶干细胞（hMSC）与ALT或端粒酶阳性细胞系和脂肪肉瘤组织之间的关系。人骨髓间充质干细胞是一种复制寿命有限且无端粒酶活性的成人干细胞群体(Zimmermann、Voss等人，2003年)这至少部分归因于染色质水平上端粒酶基因的活性抑制，类似于ALT细胞系的情况(Cairney&Keith，2008年;Serakinci，Hoare等人，2006年). 然而，hMSC并不显示ALT的特征性分子标记(Bernardo，Zaffaroni等人，2007年;赵力等，2008). 因此，hMSCs转化后可能成为ALT或端粒酶阳性肿瘤。然而，在操作由此产生的端粒维持机制之前，需要对这两种机制（如我们的机制）之间决定的分子细节建立准确的模型。
层次聚类分析表明，hMSC中特征基因的表达谱与ALT的关系比与具有较大特征的端粒酶阳性细胞系的关系更为密切，当使用改进的297基因特征时，也与ALT脂肪肉瘤密切相关，这表明ALT起源于间充质干细胞。
间充质干细胞是已知的潜在转化靶点在体外在这些细胞中缺乏任何端粒维持机制可能是一种肿瘤抑制机制，因为hTERT转导在长期培养后可延长其寿命并诱导肿瘤特征在体外和肿瘤形成体内(Serakinci，Guldberg等人，2004年). 此外，一些研究表明MSC在长期培养后能够自发转化在体外在小鼠系统中(Miura，Miura等人，2006年;Zhou，Bosch-Marce等人，2006年)尽管人类系统中的情况仍不清楚，有相互矛盾的报告表明，自发转化的能力可能取决于来源组织(Bernardo，Zaffaroni等人，2007年;Miura，Miura等人，2006年;Rubio，Garcia-Castro等人，2005年;Wang，Huso等人，2005年). 最近几项研究已将hMSC与包括尤因肉瘤在内的间叶恶性肿瘤联系起来(Riggi，Suva等人，2008年;Tirode，Laud-Duval等人，2007年)和恶性纤维组织细胞瘤(Matushansky，Hernando等人，2007年). 干细胞样肿瘤起始细胞也已从各种间充质肿瘤中分离出来(Gibbs，Kukekov等人，2005年;Wu，Wei等人，2007). 综上所述，这些数据表明，癌症的干细胞起源延伸至间叶恶性肿瘤。
尽管之前已经在许多场合证明了ALT在间充质组织中的优势，但据我们所知，这是首次将ALT与间充质干细胞来源联系起来。此外，这不仅仅反映了ALT细胞系的间充质起源，因为ALT和端粒酶阳性脂肪肉瘤样本都是间质衍生的，只有ALT脂肪肉癌与hMSC聚集。这种关联的重要性目前尚不清楚，但肯定需要进一步调查。
总之，我们发现了一种基因表达特征，能够在细胞系和脂肪肉瘤组织样本中区分端粒酶阳性和ALT阳性。该特征包含一个涉及ALT中hTERT阻遏的调节性信号网络，并表明ALT的hMSC起源是一种新的来源。所提供的结果允许我们假设ALT和端粒酶永生起源的靶细胞的两个潜在模型。要么（1）端粒酶阳性和ALT表达的恶性肿瘤存在两个独立的起源细胞，要么（2）端粒素酶阳性和ALT肿瘤来自同一起源细胞。在后一种情况下，来源细胞是hMSC，端粒酶阳性肿瘤随着时间的推移获得了与hMSC来源不同的分子特征，而ALT肿瘤保持干细胞特征，可能部分是通过端粒酶基因抑制等机制。这里的数据支持后一种情况，但需要对已知利用ALT机制的其他肿瘤类型（如胶质瘤）进行进一步研究(Chen，Hakin-Smith等人，2006年)、肾上腺皮质癌、乳腺癌、恶性黑色素瘤、肺癌、卵巢癌(Bryan，Englezou等人，1997年)和肾癌(Mehle、Piatyszek等人，1996年). 更好地了解TMM在来源细胞中的调控将增加我们对这些肿瘤类型生物学基础的认识，并可能突出治疗干预的新领域。
