选择性剪接神经元一氧化氮合酶介导阴茎勃起

摘要

一氧化氮（NO）是由来自不同基因的三种主要酶合成的，这三种酶分别是诱导型一氧化氮合酶（iNOS）、内皮型一氧化氮合成酶（eNOS）和几种神经型一氧化氮合物变体（nNOS）(1). 阴茎勃起由nNOS和eNOS产生的NO介导(2)，前者开始安装(3)，后者提供持续的最大勃起(4). 不同形式NOS对阴茎勃起的相对贡献尚不清楚，尤其是因为nNOSα（nNOS^−/−)以及eNOS^−/−动物(5–7). 在本研究中，使用nNOS^−/−(8)、eNOS^−/−(9)和双突变小鼠(10)（dNOS^−/−)，我们发现nNOS的选择性剪接形式介导了阴茎勃起的主要部分。

结果和讨论

我们通过监测海绵内压（ICP）来评估勃起功能，ICP是对不同电压下海绵体神经电刺激的反应(图1A类). 所有转基因动物都保持勃起状态，在测试的最高电压（6 V）下，各组之间没有显著差异。然而，nNOS^−/−和dNOS^−/−动物对低电压刺激的反应较弱。1 V时，nNOS^−/−和dNOS^−/−这些动物的ICP刺激变化仅为WT动物的4%和26%。相反，eNOS^−/−动物对电刺激似乎过于敏感，与WT相比，1-4V时的反应增加了150-300%。

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图1。

转基因小鼠对神经刺激的勃起反应。(A类)通过增加ICP测量的电刺激勃起(22)在nNOS的低电压下降低^−/−和dNOS^−/−应变，但在较高电压下几乎与WT响应相同。电子NOS^−/−在所有测试电压下，动物比WT更敏感。*，P（P）< 0.01; ∗∗,P（P）< 0.05. (B类)我-NAME更有效地抑制nNOSα和dNOS缺失小鼠中4-V刺激介导的勃起，而eNOS^−/−菌株对抑制更具抵抗力。我-名称IC₅₀值为：WT，4.2 mM；电子NOS^−/−1.6毫米；nNOSα^−/−0.95毫米；和dNOS^−/−，0.44 mM。数据为每剂量3-15只动物的平均值±SEM。(插入)转基因动物初始剂量-反应曲线的放大。(C类)勃起2分钟4-V刺激（实心棒）的典型轨迹，然后注射15 mM我-小鼠阴茎中的NAME（在孵化标记处）和第二次刺激4V。dNOS的不规则不稳定根尖反应^−/−鼠标清晰可见。ICP的峰值变化是指在刺激间隔期间保持至少20秒的最高持续压力峰值。

我们想知道突变小鼠的持续勃起是否反映了残留的NO-生成系统或与NO无关。我们评估了我-硝基精氨酸甲酯(我-NAME），非选择性抑制所有形式的NOS(11). 令人惊讶的是，所有三只突变小鼠都对通过我-NAME，双突变小鼠的敏感性是WT和nNOS的10倍^−/−和eNOS^−/−动物的敏感性分别提高5倍和2.5倍(图1B类). 这种超敏性可能反映出我-NAME可抑制突变动物体内少量的nNOS。在较高剂量下，我-NAME抑制在所有组中相似。我们还注意到转基因小鼠受刺激勃起模式的显著差异。数字一氧化氮合酶^−/−尤其是小鼠，表现出不规则和功能失调的priapic活动(图1C类).

nNOS中电刺激勃起功能的保存^−/−动物表明神经纤维含有残余NOS。因此，我们比较了总NOS在体外WT和转基因penes中的NOS活性(图2A类). eNOS中总NOS活性降低30-40%^−/−组织和近90%的nNOS^−/−和双淘汰赛准备。剩余活性被500μM完全抑制我-姓名。因为在正常的WT大鼠和小鼠阴茎组织中未检测到iNOS(5)，我们想知道选择性剪接形式的nNOS是否可以维持勃起活动。在某些脑区，选择性剪接和催化活性的nNOSβ已被描述(12)而另一种选择性剪接形式nNOSγ也存在于nNOS中^−/−大脑但缺乏催化活性(13). 我们进行了就地nNOS主要α型和催化活性β型的杂交(图2B类). 在WT小鼠中，NOSα和-β均在骨盆神经节的神经元胞体中突出，这导致阴茎的海绵体神经支配。使用识别α和β形式的普通探针观察到类似的定位。nNOSαmRNA的染色在nNOS中被消除^−/−动物，但nNOSβ没有明显减少，这与删除外显子2的突变小鼠的设计一致，使那些缺乏蛋白质N末端部分的形式不受影响。

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图2。

转基因小鼠中存在酶活性交替剪接的nNOS。(A类)测定阴茎匀浆中总NOS活性在体外通过将精氨酸转化为瓜氨酸(23)并与WT活性进行比较。WT动物的总NOS活性为每毫克蛋白质367±73 pmol/min。在控制中，我-500μM时添加的NAME阻止了所有活动。数据是六到七只动物的平均值±SEM。(B类)现场WT和nNOS的杂交^−/−使用对α或βnNOS亚型特异性RNA或对所有nNOS亚型共有的序列的正义和反义探针的小鼠骨盆神经节。实心箭头和破碎箭头分别指向染色和未染色的神经元细胞核。(C类)WT和nNOS中的瓜氨酸染色^−/−阴茎组织。支架标志着阴茎动脉的内皮表面。箭头标记了海绵状神经中一个明显染色的神经纤维。(插入)无一抗背景染色。

为了研究残留的nNOSβ是否在神经纤维中产生NO，我们对阴茎组织进行瓜氨酸染色，这反映了完整动物中NOS的活性(14) (图2C类). 我们观察到阴茎海绵体和背神经以及海绵窦和阴茎血管内皮组织中的瓜氨酸染色。nNOS中瓜氨酸染色不减少^−/−阴茎切片。nNOS表观NOS活性的保持^−/−完整的萜烯可能反映出残余NOS生成瓜氨酸（可能还有NO）的能力更强体内但不是在体外或者可能反映出突变动物中瓜氨酸的降解减少。为了区分这些可能性，我们评估了新鲜组织中神经元产生NO的情况。首先，我们测量了钙²⁺-疱疹病毒lacZ标记转基因动物纯化海绵体神经细胞中NOS的依赖性活性(图3A类)，如上所述(15,16). 尽管WT和eNOS^−/−动物具有与预期相似的神经元NOS活性，即nNOS^−/−和dNOS^−/−动物具有60%和57%的WT活性。该活性是钙依赖性的，可被选择性nNOS抑制剂7-硝基吲哚唑完全消除。为了进一步证实转基因小鼠中nNOS的活性，我们对分离的盆腔神经节进行了黄递酶组织化学染色(17)，这反映了NOS的催化活性。神经元细胞体中WT、eNOS的这种染色类似^−/−，无操作系统^−/−和dNOS^−/−小鼠(图3B类).

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图3。

转基因小鼠剩余NOS活性的神经定位。(A类)钙依赖性药物和100μM 7-硝基吲哚唑（7-NI）抑制分离的海绵体神经组织中精氨酸转化为瓜氨酸的作用维持在eNOS中^−/−动物和nNOS减少^−/−和dNOS^−/−菌株。数据为三到五次测量的平均值±SEM。EGTA（5 mM）或我-NAME（100μM）也完全抑制NOS活性。(B类)所有转基因菌株的骨盆神经节中都保留了黄递酶活性对大型神经元细胞体的组织化学定位。数据代表了取自两种不同动物的神经节的三种不同染色程序。

总之，我们的研究结果表明，选择性剪接的nNOSβ介导了阴茎勃起的大部分。尽管在nNOS突变小鼠阴茎组织提取物中监测到的NOS催化活性降低了90%，但在突变小鼠中，瓜氨酸或NADPH黄递酶染色或海绵体神经裂解物的NOS活性没有明显降低。一氧化氮/瓜氨酸的nNOSβ生成也保存在nNOS的大脑中^−/−动物(14).

nNOSβ的独特性质可能解释其强大的NO生成能力，以维持nNOS的勃起功能^−/−动物(18). nNOSβ缺乏与PSD95结合的N末端PDZ结构域，PSD95是突触后密度蛋白，将nNOSα锚定在神经元膜上，并将nNOS连接到NMDA谷氨酸受体(13). nNOSβ缺乏与质膜的栓系可能提供更大的体内比在体外活动。此外，nNOSβ中缺乏与NOS蛋白抑制剂（NOS的内源性抑制剂）结合的结构域(19)，也可能增强体内催化活性。

由于其独特的性质，nNOSβ可能成为治疗勃起功能障碍、心血管疾病和其他NO缺乏症的新的治疗靶点。一只完全缺乏nNOSα、-β和-γ的nNOS缺乏小鼠是不育的(20,21). nNOSα^−/−、eNOS^−/−和dNOS^−/−我们研究中使用的动物都是可生育的，这表明功能性nNOS在正常生殖功能中起着至关重要的作用。

方法

鸣谢

缩写

脚注

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