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SARS冠状病毒的分子生物学。2009年7月22日:129–151。
2009年7月22日在线发布。 数字对象标识:10.1007/978-3-642-03683-5_9
预防性维修识别码:PMC7176212号

SARS冠状病毒核衣壳蛋白的结构、功能和治疗潜力

客座编辑:Sunil K.Lal
印度新德里Aruna Asaf Ali Marg国际遗传中心工程与生物技术部,110067

摘要

与其他冠状病毒一样,核衣壳蛋白是SARS冠状病毒(CoV)的核心成分之一。它低聚形成一个封闭的胶囊,基因组RNA被安全地储存在胶囊中,从而为严重急性呼吸系统综合征冠状病毒基因组提供了抵御宿主环境恶劣条件的第一道防线,并有助于病毒的复制和繁殖。除此功能外,一些报道还表明,SARS-CoV核衣壳蛋白调节各种宿主细胞过程,从而使宿主的内部环境更有利于病毒的生存。本文将分析和讨论有关核衣壳蛋白这些不同性质的现有文献。在文章的最后,我们还将讨论一些关于核衣壳蛋白作为SARS-CoV感染候选诊断工具和疫苗的临床相关应用的最新报告。

关键词:核衣壳蛋白,尖峰蛋白,Smad结合元件,Sumoylation基序,模型感染系统

介绍

根据定义,核衣壳是包裹基因组(DNA或RNA)的病毒蛋白外壳。核衣壳蛋白是病毒核衣壳的主要成分。它能够与自身和基因组结合,从而将基因组封装在一个封闭的腔中。在一些病毒中,核衣壳蛋白也可能由其他病毒辅因子协助形成衣壳。然而,在冠状病毒(包括SARS-CoV)中,核衣壳蛋白本身能够形成衣壳。该病毒编码核衣壳蛋白的主要优点是,后者将病毒基因组包裹起来,保护其免受宿主恶劣环境的直接接触。事实上,在一些简单的病毒如戊型肝炎病毒和脊髓灰质炎病毒中,核衣壳蛋白是保护基因组免受外界影响的唯一外壳。然而,在复杂病毒中,如乙型肝炎病毒和冠状病毒(包括SARS-CoV),核衣壳被由其他病毒蛋白组成的额外外壳覆盖(尖峰蛋白是该外壳的主要成分)。除此之外,一些病毒的核衣壳蛋白已被证明在病毒发病过程中发挥多重调节作用。它们具有特定的结构基序和/或特征序列,通过这些基序和特征序列,它们与其他病毒/宿主因子相关联,并以更利于病毒生存的方式扭曲宿主细胞机制。核衣壳蛋白也是表达最丰富的病毒蛋白之一,是恢复期抗血清识别的主要抗原。因此,评估其作为病毒候选诊断工具或疫苗的潜力是很有吸引力的。

因此,了解核衣壳蛋白的特性对于任何病毒学家来说都是至关重要的,以便了解病毒的生物学并开发有效的工具来控制感染。自2003年鉴定和分离SARS-CoV以来,世界各地的一些实验室都将研究重点放在了核衣壳蛋白的各种性质的表征上。间接衡量SARS-CoV研究人员对核衣壳蛋白研究的好奇心的一个方法是,在PubMed中,专注于核衣壳蛋白质的SARS-CoV研究出版物数量仅次于穗蛋白。从这些文章中积累的证据帮助我们对这种蛋白质的性质有了实质性的了解。在这篇文章中,我们将全面描述核衣壳蛋白的所有不同性质,这些性质是由几个实验室的独立工作人员建立的。在结束本文时,我们将讨论这个领域中需要在未来解决的一些剩余挑战。

N-蛋白质:结构和组成

核衣壳(N)蛋白由SARS-CoV的第九个ORF编码。同一个ORF也编码另一种称为ORF9b的独特辅助蛋白,尽管在不同的阅读框中,其功能尚未确定。N蛋白是一种由422个氨基酸组成的46-kDa蛋白质(Rota等人。2003). 其N末端区域主要由带正电的氨基酸组成,这些氨基酸负责RNA结合。C末端氨基酸373和390之间存在一个富含赖氨酸的区域,该区域被预测为核定位信号。除此之外,中间区域存在一个富含SR的基序,包含177-207个氨基酸。Chang等人进行的生物物理研究(2006)提出该蛋白由两个独立的结构域和一个连接区组成。第一个结构域位于假定的RNA结合域内的N末端,第二个结构域由能够自我结合的C末端区域组成。在这两个结构域之间,有一个高度无序的区域,它起着连接剂的作用。据报道,该区域与膜(M)蛋白和人类细胞hnRNPA1蛋白相互作用(Fang等人。2006; Luo等人。2005). 此外,该区域也被预测为磷酸化的热点。因此,总的来说,N蛋白可以分为三个不同的区域(图。9.1),可能在病毒生命周期的不同阶段发挥完全不同的功能。其他冠状病毒核衣壳蛋白也有类似的组织模式。

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SARS-CoV核衣壳蛋白的结构。示意图显示了迄今为止确定的不同领域。数字1-422对应于N个基因。GKEE代表sumoylation基序(赖氨酸残基)。KEL是RXL基序,负责与细胞周期蛋白D结合,SPAR是通过细胞周期蛋白-CDK复合物(丝氨酸残基)磷酸化的基序。S177是被GSK3磷酸化的丝氨酸177残基

N蛋白的稳定性

Luo等人进行的In-vitro热力学研究(2004年b)使用纯化的重组N蛋白表明,它在pH7到10之间是稳定的,在pH9附近具有最大的构象稳定性。此外,观察到它经历了不可逆的热诱导变性。它在35°C时开始展开,在55°C时完全变性(Wang等人。2004). 然而,尿素或氯化胍等化学物质诱导的N蛋白变性是一个可逆过程。

翻译后修改

与其他冠状病毒N蛋白一样,SARS-CoV N蛋白已被预测,并在后来的实验中被证明会经历各种翻译后修饰,如乙酰化、磷酸化和琥珀酰化。

乙酰化是实验证明的N蛋白的第一个修饰。通过对几名SARS患者恢复期血清的质谱分析表明,N的N端蛋氨酸被清除,所有其他蛋氨酸被氧化,生成的N端丝氨酸被乙酰化。然而,这种修饰的功能相关性(如有)仍有待阐明(Krokhin等人。2003).

N蛋白的另一个独特修饰是它能够被酰化。Li等人的研究(2005年a)已经明确证明哺乳动物细胞中异源表达的N是sumoylated。使用定点突变方法,sumoylation基序被映射到第62个赖氨酸残基,该残基存在于假定的sumo修饰域(GK)中62EE)。他们的数据进一步表明,sumoylation可能在调节N蛋白的同质异构化、核仁易位和细胞周期放松调控特性方面发挥关键作用。Fan等人进行的另一项独立研究进一步支持了N蛋白的sumoylation(2006)其中,他们证明了N蛋白和Hubc9之间的关联,Hubc9是一种sumoylation系统的泛素结合酶。他们还将交互作用域映射到SR-rich基序,这与之前的报告一致。然而,他们未能检测到GKEE基序在介导这种相互作用中的参与(Fan等人。2006).

最初,预测SARS-CoV N蛋白被严重磷酸化。后来,从我们实验室以及其他研究人员获得的结果来看,现在很明显,N蛋白是多种细胞激酶的底物。氮蛋白磷酸化状态的第一个实验证据来自Zakhartchouk等人的研究(2005)其中,使用[32P] 正磷酸盐标记,他们能够观察到293T细胞中腺病毒载体表达的N蛋白的磷酸化。我们实验室的进一步研究清楚地证实了这一观察结果。大多数N蛋白在其丝氨酸残基处被磷酸化(尽管苏氨酸和酪氨酸残基的参与无法检测到;它们可能在体内发生)。此外,通过各种生化检测,证明至少在体外,N蛋白可以被丝裂原活化蛋白激酶(MAP激酶)、细胞周期依赖性激酶(CDK)、糖原合成酶激酶3(GSK3)和酪蛋白激酶2(CK2)磷酸化。此外,该数据提供了有关N蛋白磷酸化依赖的核质穿梭的初步指示(Surjit等人。2005). Wu等人最近发表的一份报告(2008)进一步证实,无论在体内还是体外,N蛋白都是GSK3酶的底物。通过各种生化和遗传分析,清楚地证明N蛋白的丝氨酸177残基被GSK3磷酸化。一种针对N蛋白磷酸177残基的抗体可以在体外和SARS-CoV感染细胞中有效检测磷酸N蛋白。有趣的是,通过生化手段抑制SARS-CoV感染细胞中的GSK3活性,也会导致病毒滴度降低约80%,并随后诱导病毒诱导的细胞病变效应。作者提出,GSK3可能是SARS-CoV复制的主要调节器,可能是因为它能够磷酸化N蛋白。然而,GSK3对其他病毒和/或宿主蛋白的磷酸化也可能是观察到的细胞病变效应的决定因素。

N蛋白的定位

与许多其他冠状病毒的N蛋白不同,SARS-CoV N蛋白在异源表达或感染细胞中主要分布在细胞质中(Surjit等人。2005; You等人。2005; Rowland等人。2005). 在感染细胞中,少数细胞出现核仁定位(You等人。2005). 正如You等人报告的那样(2005),N蛋白包含pat4、pat7和双部分型核定位信号。据预测,它还具有潜在的依赖于CRM-1的核出口信号。然而,关于这些特征序列参与调节N蛋白定位的实验证据尚不明确。有趣的是,我们实验室的研究表明,在缺乏血清的细胞中,大多数N蛋白定位于细胞核。这种现象可以在生化分馏和免疫荧光研究中重复观察到。此外,用不同细胞激酶的特异性抑制剂(如CK2抑制剂和CDK抑制剂)处理细胞,可使部分N蛋白保留在细胞核中,而GSK3和MAPK抑制剂的作用很小。此外,发现N蛋白被细胞周期蛋白-CDK复合物有效磷酸化,已知该复合物仅在细胞核中活性。还发现N蛋白以磷酸特异性方式与14-3-3蛋白结合,siRNA对14-3-3θ蛋白水平的抑制导致N蛋白的核积累。尽管这些实验太过初步,无法最终提供关于N蛋白在细胞内定位的任何答案,但它们确实提供了关于在某些情况下,N蛋白在细胞核中的物理存在的实质性线索,这可能是一种非常动态的现象。Timani等人进行的另一项研究(2005)使用融合到EGFP的N蛋白的不同缺失突变体表明,含有NLS1(aa 38-44)的N蛋白N末端定位于细胞核,而含有NLS2(aa257-265)和NLS30(aa 369-390)的C末端定位于细胞质和核仁。通过结合不同的缺失突变体,他们得出结论,N蛋白可能充当细胞质-细胞核和核仁之间的穿梭蛋白。综上所述,所有这些结果进一步表明,N蛋白本身具有定位于细胞核的物理能力。这种定位是通过潜在NLS的磷酸化介导激活来调节的,还是通过与另一个细胞核蛋白相关联的背驮作用,还是通过任何其他机制来调节的还有待确定。

基因组封装:病毒衣壳蛋白的主要功能

作为衣壳蛋白,N蛋白的主要功能是将基因组RNA包裹在一层保护膜中。为了实现这种结构,N蛋白必须具有两种不同的特性;例如(1)能够识别基因组RNA并与之结合,以及(2)自我结合成寡聚体形成衣壳。严重急性呼吸系统综合征冠状病毒的N蛋白已被实验证明在体外具有这些特性,如下所述。

与基因组RNA的识别和结合

关于N蛋白的RNA结合特性的第一个实验证据来自Huang等人的工作(2004)其中,通过核磁共振研究,他们证明了N末端结构域与几种病毒3′非翻译RNA序列关联的能力。此外,Chen等人(2007)报告在N蛋白的C末端区域(残基248-365)存在另一个RNA结合域,这被认为是比N末端更强的相互作用。基于RNA与蛋白质相互作用的结构分析,他们进一步认为基因组RNA由N蛋白以螺旋方式包装。在Luo等人发表的另一份报告中(2006)N蛋白的RNA结合基序被映射到氨基酸残基363–382。总之,N蛋白的RNA结合能力归因于其两个不同的结构域:N末端结构域(残基45-181)和C末端二聚结构域(残留物248-365)。这两个区域在空间上被无序区域的长延伸分隔开。Chang等人最近进行的一项研究(2008)已证明这些无序区域的RNA结合能力。他们提出,N蛋白的不同RNA结合域可以合作提高N蛋白的总RNA结合效率,也可以作为N蛋白与其他病毒和/或宿主核酸和/或蛋白质结合的相互作用中心。

也许迄今为止,关于N蛋白包装基因组RNA的能力的最令人信服的证据来自于谢等人的工作(2005). 他们建立了一个系统,通过将棘突、膜、包膜和核衣壳cDNA共同转染到Vero E6细胞中来产生SARS-CoV VLP。在测试将与严重急性呼吸系统综合征冠状病毒包装信号融合的携带GFP的RNA包装到该颗粒中时,他们观察到N蛋白的存在是绝对需要的。然而,N蛋白对组装空粒子本身并不是必需的。此外,通过使用重组N蛋白进行过滤结合分析,他们能够识别N蛋白中的两个独立的RNA结合域;一个位于N终点(aa 1–235),另一个位于C终点(aa236–384)。这些结果与之前的发现一致,并进一步表明这两个区域可能在体内具有功能。未来使用模型感染系统的实验将证实这些观察结果。

衣壳的形成

N蛋白对基因组包被所需的最关键的特性之一是其自我结合的能力。因此,许多实验室致力于描述这种现象,着眼于开发可能的干扰策略,以帮助限制病毒传播。

我们实验室使用酵母双杂交分析进行的初步研究表明,N蛋白能够通过其C-末端氨基酸209残基进行自我结合(Surjit等人。2004年a). He等人进行的一项平行研究(2004)利用哺乳动物双杂交系统和蔗糖梯度分馏也证明了N蛋白自结合形成低聚物的能力。他们进一步将相互作用区域映射到包含SR丰富基序的184-196个氨基酸残基。然而,这两项研究中绘制的交互作用域存在一些差异。随后,陈的实验室进行了广泛的生物物理和生化分析(Yu等人。2005,2006)和Jiang的实验室(Luo等人。2006,2005)丰富了我们对N蛋白齐聚过程的理解。总之,富含SR的基序确实具有结合亲和力,但这是针对另一种N蛋白分子的中心区域(aa 211–290)而非富含SR基序本身的。C末端区域(aa 283–422)具有自身的结合亲和力,并以浓度依赖的方式结合成二聚体、三聚体、四聚体或六聚体。N蛋白寡聚的基本序列被鉴定为残基343-402。有趣的是,该区域还包含N蛋白的RNA结合基序,这促使我们推测RNA结合和N蛋白寡聚活性之间可能存在相互作用。此外,寡聚反应被观察到与静电相互作用无关,并将单链DNA添加到含有促进寡聚的N蛋白四聚体的反应混合物中。因此,有人提出,一旦四聚体通过核衣壳分子之间的蛋白质-蛋白质相互作用形成,与基因组RNA的结合将促进完整核衣壳结构的进一步组装。

N蛋白对宿主细胞过程的扰动

许多冠状病毒的N蛋白除了是病毒的衣壳蛋白外,还兼具调节蛋白的功能。SARS-CoV的N蛋白也被证明在体外调节宿主细胞机制,从而表明其在病毒生命周期中可能发挥调节作用。下文讨论了受N蛋白异源表达干扰的一些主要细胞过程。

宿主细胞周期的放松调控

三个不同的小组报告了N蛋白在体外干扰宿主细胞周期的能力。李等人完成的工作(2005年a,2005年b)证明N蛋白中sumoylation基序的突变导致细胞周期阻滞。

我们实验室的工作表明,表达N蛋白的细胞中S期进展受到抑制(Surjit等人。2006). 此外,在SARS-CoV感染的细胞裂解液中发现S期特异性基因产物如cyclin E和CDK2下调,这表明所观察到的现象可能与体内有关。为了进一步阐明N蛋白诱导细胞周期阻滞的机制,进行了一些生化和突变分析。由此获得的结果表明,N蛋白直接抑制细胞周期蛋白-CDK复合物的活性,导致视网膜母细胞瘤蛋白磷酸化降低,同时E2F1介导的反式激活也随之下调。通过对RXL和CDK磷酸化突变N蛋白的分析,确定了抑制CDK4和CDK2活性的机制不同。尽管N蛋白可以直接与细胞周期蛋白D结合并抑制CDK4–细胞周期蛋白D复合物的活性,但CDK2活性的抑制似乎是通过两种不同的方式实现的:间接通过下调CDK2、细胞周期蛋白E和细胞周期蛋白A的蛋白水平,以及通过N蛋白与CDK2–细胞周期蛋白复合物的直接结合。

第三批支持N蛋白解除宿主周期调控能力的证据来自Zhou等人的工作(2008). 他们观察到,在N蛋白表达的293T细胞中,从S期到G2/M期的转变较慢,生长速度较慢。他们还观察到,在感染了表达SARS-CoV N蛋白的逆转录病毒的人类外周血淋巴细胞和K562细胞中也存在类似现象。

抑制宿主细胞细胞分裂

Zhou等人采用酵母双杂交文库筛选方法寻找N蛋白C末端(aa 251-422)的相互作用伙伴(2008)发现人类延伸因子1α(EF1α)作为候选伴侣。通过各种体外和体内试验证实了相互作用的特异性。此外,N蛋白的表达诱导EF1α的聚集。众所周知,大多数细胞EF1α与F-actin结合并促进F-actin捆绑,这是胞质分裂期间的关键事件(Kurasawa等人。1996; Yang等人。1990). 因此,作者测试了N蛋白诱导的EF1α聚集是否影响F-actin捆绑和胞质分裂。正如预期的那样,他们在N蛋白表达细胞中观察到F-actin束显著减少。事实上,Surjit等人也观察到了类似的F-actin分布模式(2004年b)在COS-1细胞中。此外,作者在稍后的时间点(转染后72小时)在N蛋白表达细胞中观察到多核细胞,表明这些细胞中的胞质分裂受到抑制。使用N蛋白的不同缺失突变体证实了上述数据的特异性,其中只有N蛋白的C末端结构域(负责与EF1α结合)能够重现上述结果。因此,有人认为,由N蛋白结合的EF1α导致其聚集,从而抑制F-肌动蛋白束并随后阻止胞质分裂。

宿主细胞翻译机制的抑制

众所周知,EF1α在翻译的肽延伸阶段起着关键作用。因此,病原体蛋白质操纵其活性以扭曲宿主翻译机制是一个很有吸引力的候选者。例如,已证明HIV-1型gag多聚蛋白与EF1α相互作用,并损害体外翻译(Cimarelli和Luban 1999)。由于Zhou等人(2008)观察到EF1α和SARS-CoV N蛋白之间的相互作用,他们进一步测试它是否干扰宿主翻译机制。事实上,N蛋白的存在以剂量依赖的方式抑制了体外和体内的总细胞翻译。此外,外源性添加过量EF1α可以逆转N蛋白诱导的翻译抑制,表明N蛋白通过干扰EF1α功能发挥其作用。然而,是否在体内重现了类似的效果尚待确认。

干扰素生成的抑制

干扰素(IFN)的产生是宿主的主要防御机制之一。然而,SARS-CoV感染不会导致IFN的产生。然而,用干扰素预处理细胞可以阻止SARS-CoV感染(Spiegel等人。2005; Zheng等人。2004). 基于这一观察,Palese的实验室研究了不同SARS-CoV蛋白的IFN抑制特性,结果表明ORF3、ORF6以及N蛋白具有通过不同机制独立抑制IFN生成的能力。发现N蛋白抑制宿主细胞中IRF3和NFkB的活性,从而抑制IFN的合成。IRF3活性也被ORF3、ORF6蛋白阻断,但抑制NFkB活性是N蛋白特有的特性。此外,ORF3、ORF6蛋白能够通过不同的机制阻断STAT1活性(Kopecky-Bromberg等人。2007). 所有这些数据表明,SARS-CoV可能利用多种因素来检测宿主免疫系统的活性,而N蛋白可能是这一过程中的主要伙伴之一。这些不同的因素可能在病毒生命周期的不同阶段独立发挥作用。在这种情况下,N蛋白的调节活性将与其结构活性一样不可或缺。

转化生长因子β信号通路的调节

在SARS爆发期间,大量患者肺部出现严重炎症,随后导致急性呼吸窘迫综合征(Ding等人。2003; Nicholls等人。2003). 急性呼吸窘迫综合征以肺纤维化为特征,肺纤维化会导致肺衰竭和患者死亡。TGFβ信号通路在肺纤维化中起着关键作用(Roberts等人。2006; 边境与贵族1994). 它增强细胞外基质(ECM)蛋白的表达,加速蛋白酶抑制剂的分泌,减少蛋白酶的分泌,从而导致ECM蛋白沉积。TGFβ还可能通过刺激成纤维细胞的趋化迁移和增殖以及通过成纤维细胞-肌成纤维细胞转变直接诱导肺纤维化。因此,值得推测的是,一些SARS-CoV编码因子可能正在调节TGFβ信号通路。事实上,其他几种病毒的蛋白,如丙型肝炎病毒核心蛋白、NS3和NS5蛋白、腺病毒E1A、人乳头瘤病毒E7、人T淋巴细胞病毒Tax和爱泼斯坦-巴尔病毒LMP1,已被报道调节TGFβ途径。一般来说,这些蛋白直接与smad蛋白结合并改变先天信号通路。

有趣的是,赵等人最近发表了一份报告(2008)发现SARS-CoV的N蛋白也与smad3相互作用并调节TGFβ途径的活性。通过对转化生长因子β靶基因(如PAI-1型(纤溶酶原激活物抑制剂1)和胶原蛋白在多种细胞系和SARS患者中的表达,作者已明确证明N蛋白确实增强了TGFβ信号通路的活性。此外,他们观察到,N蛋白对TGFβ信号传导的影响仅通过smad3介导(独立于smad4的参与)。在试图揭示这一现象背后的机制时,他们观察到与smad3的MH2结构域(对磷酸化smad3具有更强的结合亲和力)特异相关的N蛋白中断了smad3和smad4之间的相互作用,并以剂量依赖的方式增强了smad3与转录辅激活因子p300之间的相互作用。为了进一步证实上述数据,他们在HPL1细胞PAI-1启动子的SBE区域进行了染色质免疫沉淀分析,并检测到smad3和p300复合体中存在N蛋白。然而,有趣的是,N蛋白抑制TGFβ诱导的HPL1细胞凋亡(smad3激活诱导HPL1凋亡是一个公认的事实)。因此,N蛋白似乎采用了一种聪明的机制,一方面,它增强了TGFβ信号通路的活性,从而导致基因子集(例如ECM蛋白编码基因)的增强表达,另一方面,其阻止宿主细胞的程序性细胞死亡。解开N蛋白这种独特特性背后的机制将是一件有趣的事情。

COX2产量上调

病毒感染期间诱导的另一个主要促炎因子是环氧化酶-2(COX2)蛋白。Yan等人使用表达N蛋白的293T细胞(2006)已经表明,N蛋白的表达导致COX2蛋白生成以转录方式上调。他们进一步证明,N蛋白通过68 aa残基结合域(aa 136–204)直接与COX2启动子中的NFkB反应元件结合,并激活其转录。

虽然已知N蛋白与核酸延伸有关,但迄今为止,还没有其他文献或预测其序列特异性DNA结合活性(作为转录因子)。在这种情况下,如果上述观察结果在体内可重复,则可能真的是N蛋白的独特特性,并可能进一步增加N蛋白的既定调节功能。

AP1活性上调

据报道,在基于ELISA的分析中,外源表达的N蛋白可增强c-fos、ATF-2、CREB-1和fos B的DNA结合活性,从而表明这些细胞中AP1活性增加(He等人。2003). 这种现象的机制细节和功能意义仍有待阐明。

诱导细胞凋亡

我们实验室的早期工作表明,当N蛋白在Cos-1猴肾细胞中表达时,在缺乏生长因子的情况下会诱导细胞凋亡。理解程序性细胞死亡机制的尝试表明,N蛋白下调了前生存因子(如细胞外调节激酶、Akt和bcl 2)的活性,上调了促凋亡因子(如caspase-3和caspase-7)的活性(Surjit等人。2004年b). 然而,在另一种上皮细胞系(huh7)中没有观察到这种现象。Zhang等人进一步证实了上述观察结果(2007). 他们报道,血清饥饿诱导表达N蛋白的COS-1细胞凋亡涉及线粒体途径的激活。Diemer等人进行的另一项优雅的研究(2008)进一步扩展了我们对N蛋白凋亡特性的理解。通过一系列涉及SARS-CoV模型感染系统和N蛋白瞬时转染的实验,作者证实了N蛋白诱导固有的凋亡途径,导致caspase-9的激活,进而导致caspase-3和-6的激活。他们的数据进一步表明,这些活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶在残基400和403处裂解N蛋白,N蛋白的核定位是裂解的绝对要求。此外,作者报道了N蛋白诱导凋亡的能力是高度细胞类型特异性的。只有在N蛋白同时定位于细胞核和细胞质的细胞(Vero E6和A549细胞)中,它才能激活半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶并被裂解;然而,在仅定位于细胞质的细胞系(Caco2和N-2a细胞)中,未观察到caspase的激活。这一现象是否在体内再现,还有待研究。

凝血酶原上调(hfgl2型)基因转录

Han等人最近的一份报告(2008)结果表明,在所有SARS-CoV结构蛋白中,只有N蛋白特异性地诱导THP-1和Vero细胞中凝血酶原基因的转录。通过执行荧光素酶报告分析hfgl2型N蛋白表达细胞中的启动子和使用N蛋白转染的细胞裂解物进行的电泳迁移率测定表明,N蛋白表达诱导转录因子C/EBPα与其同源反应元件的结合hfgl2型启动子,导致hfgl2型基因。由于SARS患者的肺部已被证明含有大量纤维蛋白,作者提出,N蛋白介导的凝血酶原基因的增加可能有助于SARS患者血栓的形成。

与宿主细胞蛋白质的关联

Luo等人(2005)利用多种生化和遗传分析报告了hnRNPA1和N蛋白之间的相互作用。发现这种相互作用是通过N蛋白的中间区域(aa 161–210)介导的。如果在体内相关,这种相互作用可能在调节病毒RNA合成中发挥重要作用。

Luo等人进行的另一项有趣的研究(2004年a)据报道,N蛋白与人类环叶素A之间存在关联。通过SPR(表面等离子体共振)分析,他们表明这是一种高亲和力的相互作用。虽然这种相互作用在体内的意义尚不清楚,但他们提出这种相互作用可能对病毒感染至关重要。值得注意的是,HIV-1 gag也与人类环叶素A结合,这种相互作用对HIV感染至关重要(Gamble等人。1996).

最近,Zeng等人(2008)据报道,N蛋白与B23结合,B23是细胞核中的一种磷蛋白。通过在hela细胞中进行体内共免疫沉淀和使用纯化的重组N蛋白进行GST下拉试验,作者证明了B23和N蛋白之间的直接相互作用。相互作用域已被映射到N蛋白的175-210个氨基酸残基,其中包括富含SR的基序。B23在细胞分裂中心体复制中起着关键作用。已知B23在苏氨酸-199残基上的磷酸化可调节其功能(Okuda等人。2000,德山等人。2001). 为了证明N蛋白与B23蛋白相互作用的功能意义,作者测试了在N蛋白存在下B23的苏氨酸199残基的磷酸化状态。有趣的是,N蛋白能够阻止苏氨酸-199磷酸化。基于这一观察,作者提出,N蛋白通过调节B23蛋白的活性,发挥其对细胞周期解除调节的作用。

总之,尽管使用多种体外实验系统提出了SARS-CoV N蛋白的几种调节作用,但没有明确证据表明其在体内发生。在缺乏合适的体内实验系统的情况下,所有这些功能都是推测性的。

N蛋白:一种有效的诊断工具

限制任何传染病爆发的最重要步骤之一是尽早诊断病原体,这可以通过检测病原体特异表达的一些标记或识别感染期间特异产生的一些宿主因子来实现。N蛋白是SARS-CoV感染早期主要表达的蛋白之一,宿主对其产生强烈的抗体反应,被认为是一种有吸引力的诊断工具。

在SARS-CoV患者的血清中,早在感染的第一天就使用单克隆抗体通过ELISA检测到了N蛋白(Che等人。2004). 此外,在感染早期检测SARS-CoV-特异性IgG、SARS-CoV RNA和N蛋白的对比研究表明,N蛋白的检测效率显著高于其他两个标记(Li等人。2005年b).

研究人员主要关注两种不同的策略,通过这两种策略,核衣壳可以用作诊断工具:(1)开发针对N蛋白的高效单克隆抗体,以及(2)生产重组表达的高纯度N蛋白,用于检测宿主中的N蛋白特异性抗体。

使用噬菌体展示方法,Flego等人(2005)已鉴定出识别N蛋白不同表位的人类抗体片段。这些可能有助于开发有效的试剂来检测受感染宿主中的N蛋白。此外,一些实验室一直在尝试开发针对N蛋白主要免疫优势表位的高效单克隆抗体,可用于ELISA检测感染早期的SARS-CoV(Shang等人。2005; Liu等人。2003; He等人。2005; Woo等人。2005). 在另一项有趣的研究中,Liu等人(2005)已开发出一种使用抗兔N蛋白抗体的免疫荧光检测方法,该抗体可以特异性地检测SARS-CoV患者在发病第二天的咽喉冲洗液样本中的N蛋白。

其他几位工作人员专注于使用多种异源表达系统经济生产高纯度重组N蛋白,这些系统可用于ELISA检测患者样本中的N蛋白特异性抗体。使用密码子优化的基因在大肠杆菌(达斯和苏雷什2006). Saijo及其同事使用杆状病毒表达系统成功表达了重组N蛋白,该系统在中和抗体检测中的效率为92%。2005). 在另一项研究中,Liu等人使用酵母表达系统表达了全长N蛋白(Liu等人。2004). 然而,由于下面讨论的几个原因,重组N蛋白的诊断使用一直是一个问题。

据报道,由于细菌衍生抗原的干扰,细菌表达的N蛋白产生假血清阳性(Leung等人。2006; Yip等人2007). 此外,一些研究表明,SARS全长N蛋白与第1组动物冠状病毒多克隆抗血清之间存在交叉反应,这可能导致检测错误(Sun和Meng,2004)。Woo等人的另一项研究也报告了全长重组N蛋白与HCoV-OC43和HCoV-229E感染患者抗血清的交叉反应性,从而得出假阳性结果。他们能够通过使用SARS-CoV的重组N蛋白和棘突蛋白的Western blot分析进一步验证ELISA结果,将这种假阳性降到最低(Woo等人。2004).

后来,邱等人和巴斯曼等人进行的研究表明,与全长N蛋白相比,N蛋白的重组表达C末端在检测SARS-CoV特异性抗血清中的作用更为特异(邱等人。2005; Bussmann等人。2006). 值得注意的是,预计该区域包含N蛋白的主要抗原位点。

在最近的一份报告中,Shin等人(2007)证明磷酸化N蛋白作为诊断抗原具有更高的功效。他们在昆虫细胞中表达N蛋白,在那里通过翻译后修饰进行磷酸化。当使用SARS阳性或阴性患者血清将该蛋白的抗原性与细菌表达的N-蛋白(未磷酸化)或去磷酸化的N-蛋白(通过用蛋白磷酸酶1处理)的抗原性进行比较时,磷酸化的N-蛋白与SARS阴性血清没有显示出任何交叉反应性,从而减少假阳性的数量。此外,磷酸化蛋白与N蛋白特异性单克隆抗体表现出更强的交叉反应性。基于这些观察结果,作者建议使用磷酸化N蛋白作为更好的诊断试剂。

此外,已经发表了一些关于通过ELISA或间接免疫荧光分析检测N蛋白特异性IgM的报告(Chang等人。2004; Hsueh等人。2004; Woo等人。2004). 然而,在这些研究中,IgM抗体的检测时间晚于IgG抗体,这与大多数其他病原体中观察到的现象形成对比。

Yu等人最近发表的一份报告(2007)试图通过在IgM ELISA中使用截短的N蛋白(aa 122–422)作为抗原来解决这个问题。他们发现,在检测到IgG反应前三天出现了IgM反应,这与从其他已知病原体获得的结果一致。此外,他们的结果显示,与健康志愿者相比,截短蛋白在检测实验室确诊的SARS患者的N蛋白特异性IgM时具有100%的特异性和敏感性。作者认为,使用这种截短的N蛋白的IgM捕获ELISA在早期SARS-CoV血清学诊断中可能更有效。

在另一份有趣的报告中,Woo等人(2005)进行了比较研究,以评估重组表达的N蛋白和Spike蛋白的相对诊断效力。他们观察到,重组N-IgG ELISA的敏感性显著高于重组S-IgG ELISA。在使用重组N和S蛋白的IgM ELISA中,情况正好相反。基于这些数据,他们建议采用ELISA检测针对S和N蛋白的IgM,而不是仅针对N蛋白(Woo等人。2005).

综上所述,所有这些数据都支持这样的观点,即N蛋白可以作为检测SARS-CoV感染的有效诊断工具。然而,生产规模的扩大和使用患者样本对特异性的进一步验证将决定这些试剂的可能临床应用。

N蛋白:一种合适的候选疫苗

N蛋白最具临床相关性的用途之一可以是用作对抗严重急性呼吸系统综合征冠状病毒感染的保护性疫苗。N蛋白是SARS-CoV的主要抗原之一。此外,从不同患者样本中分析的N蛋白显示基因序列的变异最小(Tong等人。2004)因此表明它是一种稳定的蛋白质,这是有效疫苗候选的首要要求。

柯林斯、拉奥和李的实验室进行的早期研究清楚地表明,N蛋白抗血清不含SARS-CoV的中和抗体(Buchholz等人。2004; Pang等人。2004; Liang等人。2005). 这可能归因于病毒包膜内的N蛋白定位,在感染期间抗体无法接触到该蛋白。值得注意的是,能够诱导中和抗体产生的最有效SARS-CoV结构蛋白是S蛋白(Buchholz等人。2004). S蛋白抗体能100%阻断病毒感染。另一方面,尽管不能诱导体液免疫,但N蛋白的表达可诱导显著的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应(Buchholz等人。2004; Gao等人。2003; Zhu等人。2004). 诱导N蛋白特异性CTL将有助于限制裂解病毒感染细胞的感染。这也将限制病毒的传播。因此,当与S蛋白疫苗联合使用时,N蛋白疫苗可能会进一步提高保护效率。一些实验室一直在探索各种策略,以评估N蛋白作为候选疫苗的潜力。

在Kim等人的优雅作品中(2004)钙网蛋白融合的N蛋白表达痘苗病毒已被证明在小鼠中产生强大的N蛋白特异性体液和T细胞免疫反应。正如作者所报道的,与钙网织蛋白的融合特异性地提高了具有挑战性的载体(牛痘病毒)的效率并显著降低了其滴度。作者提出,在S蛋白抗体依赖性增强(ADE)感染的情况下,N蛋白可能是作为靶抗原的合理选择。然而,在接种针剂介导的疫苗期间未观察到ADE现象(Buchholz等人。2004). Wang等人进行的另一项研究(2005)已尝试使用表达S、M和N蛋白的质粒DNA作为有效的疫苗候选。尽管他们报告了产生一些B细胞和T细胞对N蛋白的反应,但S和M蛋白获得了较强的免疫反应,从而缩小了N蛋白作为合适候选疫苗的选择范围(Wang等人。2005). Zhao等人也报告了类似的质粒介导疫苗接种方法(2004)其中,他们用表达N蛋白的DNA构建物(pCI载体)免疫小鼠。他们也报道了在动物中产生了强大的B细胞和T细胞免疫反应。另一组工作人员也报告了N蛋白作为DNA疫苗的成功使用。他们通过粘膜内注射N蛋白表达质粒载体免疫小鼠,并能够获得特定的体液和T细胞反应(Zhu等人。2004).

据报道,N蛋白作为肽基疫苗也具有潜在的应用价值。刘等人进行的系统研究(2006)揭示了能够有效刺激免疫反应的N蛋白的免疫优势表位。他们还推导出了小鼠、猴子和人类的一些保守的免疫优势表位,这可能有助于疫苗的设计。

高的实验室最近发表的一份报告进一步证明了基于N蛋白的疫苗的有效性(Zhao等人,2007年)。通过使用跨越N蛋白的重叠合成肽,他们确定了SARS-CoV N蛋白中的主要辅助T细胞表位。用含有这些主要TH细胞表位的肽免疫小鼠,可在体内产生较强的细胞免疫。用辅助肽启动显著加速了N蛋白诱导的免疫反应。此外,通过与SARS-CoV尖峰蛋白的保守中和表位融合,两种TH细胞表位承载肽与单独的尖峰表位或其与N的TH表位的混合物相比,有助于在体内产生更高滴度的中和抗体。因此,通过融合N和S蛋白,实际上可能产生更好的免疫反应。然而,他们的报告中确定的TH表位对小鼠是特异性的,因此对人类没有用处。然而,他们的数据为基于肽的抗SARS-CoV疫苗的设计提供了有用的信息。

Pei等人进行的另一项有趣的研究(2005)报告了N蛋白作为粘膜疫苗候选物的可能用途。他们在乳杆菌它是一种食品级细菌,通过口服或粘膜内的方式对小鼠进行攻击。作为初步证据,他们能够在口服激发动物的血清中观察到显著的N蛋白特异性IgG。

未来展望

对于研究界来说,这是一项重大成就,在短时间内,我们能够对N蛋白的结构和功能特性获得更为明确的理解。然而,值得一提的是,这里所做的所有研究都是用分离的重组表达的N蛋白进行体外实验。因此,目前我们可以得出的结论是,N蛋白本身具有执行上述功能的物理能力,换句话说,N蛋白确实具有必要的签名序列或基序或构象,以便在适当的情况下执行这些功能。病毒感染期间是否在体内重现类似事件取决于几个标准:(1)其他病毒因子对N蛋白活性的净影响,(2)N蛋白的净翻译和周转率,(3)有利的细胞内环境,以及(4)其他病毒因子对已经扭曲的细胞途径的净调节。因此,在SARS-CoV感染模型中重新评估N蛋白的特性将是一件有趣的事情。然而,由于感染系统的用户友好性和可访问性有限,我们可能仍必须借助体外系统来进一步分析N蛋白的特性。Chang的实验室已经建立了一个更好的实验系统(Hsieh等人。2005)其中所有结构蛋白在293T细胞中共表达形成VLP。如果可以进一步改进该系统,将这些不同蛋白质的合成速率优化到接近体内水平,那么至少可以让我们研究N蛋白相对于其他病毒蛋白质的净效应。进一步建立复制子系统也可能有帮助。此外,需要详细分析几个实验室报告的一些有趣的初步观察结果。首先,需要进一步表征和绘制所报告的N蛋白与基因组RNA包装信号的相互作用。由于N蛋白的寡聚结构域和RNA结合区域相互重叠,因此建议利用复制子系统或粒子组装系统进一步表征调控基因组并入和衣壳组装的可能性。此外,应在颗粒组装系统中或至少在存在其他病毒辅助蛋白的情况下进一步表征所报告的N蛋白调节不同细胞路径的能力。

初步研究揭示的N蛋白最独特和重要的特性是其作为序列特异性DNA结合因子的能力。已经证明可以绑定的NFkB响应元素COX2型促进剂和增强COX2型基因表达。这种活性可能进一步使N蛋白能够操纵感染细胞的整个基因表达程序。因此,应开展研究,详细分析这一现象。这似乎值得如此关注,因为Palese实验室的另一项研究证明了N蛋白抑制NFkB活性的能力,从而抑制了IFN的合成。此外,Liao等人(2005)报道了Vero E6细胞中N蛋白对NFkB的激活,He等人(2005)未能检测到同一单元格中NFkB活性的任何变化。因此,需要澄清N蛋白是否增强NFkB活性,如果是,是否上调COX2型通过直接DNA结合的转录是该启动子特有的特性,或者是一种全球现象。在这种情况下,N蛋白解除感染细胞中COX2和IFN表达调控的能力可能存在复杂的相互作用。

最后,已知N蛋白是SARS-CoV中表达最丰富的蛋白。因此,从该蛋白分析中产生的任何信息,无论是体内还是体外,都将肯定有助于提高我们对SARS-CoV生物学的理解,并可能有助于设计更好的保护工具。

致谢

作者希望感谢Alisha Lal女士帮助键入和格式化此评论。我们向所有那些我们可能在本文中忽略引用其工作的同事道歉。

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文章来自SARS冠状病毒的分子生物学由提供自然出版集团