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细胞宿主微生物。2020年4月8日；27（4）：671–680.e2。
2020年3月16日在线发布。 数字对象标识：2016年10月10日/j.chom.2020.03.002
预防性维修识别码：PMC7142693号
PMID：32183941

序列同源性和生物信息学方法可以预测SARS-CoV-2免疫应答的候选靶点

阿尔巴·格里福尼,1 约翰·西德尼,1 Yun Zhang（张云）,2 理查德·谢尔曼,1,2,三 比约恩·彼得斯,1,4和亚历山德罗·塞特1,4,5,∗
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

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补充资料
数据可用性声明

总结

针对2019年新型冠状病毒（SARS-CoV-2）最近出现和迅速蔓延的有效对策，需要开发数据和工具，以了解和监测其传播和免疫应答。然而，关于SARS-CoV-2免疫应答靶点的信息很少。我们使用免疫表位数据库和分析资源（IEDB）对与其他冠状病毒相关的可用数据进行了编目。这包括SARS-CoV，它与SARS-CoV-2具有高度序列相似性，是表位反应方面最具特征的冠状病毒。我们在SARS-CoV-2中发现了与SARS-CoV病毒高度同源的多个特定区域。确定平行生物信息预测先验的SARS-CoV-2的潜在B和T细胞表位。使用两种方法对相同区域的独立识别反映出这些区域很可能是SARS-CoV-2免疫识别的潜在目标。这些预测可以促进针对这种高度优先的病毒的有效疫苗设计。

关键词：SARS-CoV、COVID-19、SARS-CoV-2、冠状病毒、T细胞表位、B细胞表位，传染病，序列保存

集锦

  • •
    SARS-CoV中10个实验定义的区域与SARS-CoV-2具有高度同源性
  • •
    平行生物信息学预测SARS-CoV-2潜在的B和T细胞表位
  • •
    独立的方法确定了相同的免疫优势区域
  • •
    保守的免疫区域对多CoV疫苗设计具有指导意义

Grifoni等人。通过与密切相关的SARS-CoV的序列同源性和先验的利用生物信息学方法预测表位。该分析为了解人类对该病毒的免疫反应以及评估诊断和疫苗候选提供了重要信息。

介绍

2019年12月31日，中国疾病控制中心（中国疾控中心）在中国湖北省武汉市报告了一组病因不明的重症肺炎病例。不久之后，公共卫生专业人员确定可能的致病因素是一种新的β冠状病毒（SARS-CoV-2）。据世界卫生组织（WHO）与中国疾病预防控制中心（CDC）和其他国家的公共卫生中心合作，截至2020年2月26日，目前疫情疫情，即新型冠状病毒肺炎（COVID-19）在全球范围内已确诊病例81109例，死亡2718人。尽管大多数病例发生在中国，但少数病例已在24个其他国家得到确认，包括日本、泰国、韩国、新加坡、越南、印度、美国、加拿大、德国、法国、意大利和阿拉伯联合酋长国。这些数字正在迅速变化。有关新冠肺炎的最新信息，请参阅世卫组织网站https://www.who.int/emergencies/diseases/novel-conarovirus-2019.

免疫表位数据库和分析资源（IEDB）是一个表位相关信息的存储库，这些信息来源于有关传染病、过敏和自身免疫的科学文献(Vita等人。，2019). IEDB还提供生物信息工具和算法，用于分析表位数据和预测新序列中的潜在表位。病毒病原体资源（ViPR）是关于人类致病性病毒的补充信息库，它将基因组、基因和蛋白质序列信息与有关免疫表位、蛋白质结构和宿主对病毒感染的反应的数据相结合(Pickett等人。，2012).

目前关于人类免疫应答识别SARS-CoV-2序列的哪些部分的信息有限。这些知识具有直接相关性，将有助于疫苗设计，并有助于评估疫苗候选免疫原性，以及监测病毒通过人群传播时突变事件和表位逃逸的潜在后果。

虽然目前还没有SARS-CoV-2的表位数据，但关于冠状病毒的表位，尤其是β冠状病毒比如SARS-CoV和MERS-CoV，它们会导致人类呼吸道疾病(德维特等人。，2016,Song等人。，2019). 在这里，我们使用IEDB和ViPR资源汇编了其他冠状病毒的已知表位位点，绘制了严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2型序列中的相应区域，并预测了可能的表位。我们还使用经验证的生物信息学工具预测可能在人类中识别的B和T细胞表位，并评估这些表位在不同冠状病毒物种中的保守性。

结果

IEDB中有大量与冠状病毒相关的数据

冠状病毒属于这个家族冠状病毒科，订单病毒目，可进一步细分为四个主要属(阿尔法-,贝塔-,伽马射线-、和Deltacoronavirus类). 几个阿尔法-和β冠状病毒导致人类轻度呼吸道感染和常见感冒症状，而其他人是人畜共患疾病，感染鸟类、猪、蝙蝠和其他动物。除了严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2型外，另外两种冠状病毒，严重急性呼吸系统综合征冠状病毒和严重急性呼吸系统综合征冠状病毒，也引起了大规模的疾病爆发，其致死率高（10%-30%），并在出现时产生了广泛的社会影响(图1) (德维特等人。，2016,Song等人。，2019).

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SARS-CoV-2（武汉-Hu-1）基因组结构与其最近亲蝙蝠（Bat-SL-CoVZXC21）、Tor2 SARS-CoV和HCoV-EMC MERS-CoV的比较

上图：四种病毒之间对应同源蛋白的编码序列（CDS）区域在基因组示意图中填充相同的颜色，以表示同源性；与预测的SARS-CoV-2蛋白没有同源性的区域为白色。下表：SARS-CoV-2和其他三种病毒之间的成对蛋白相似性（表示为%同一性）。

人类对SARS-CoV-2的免疫反应尚待鉴定，但已对人类对其他冠状病毒的免疫反应进行了研究。截至2020年1月27日，IEDB已收集到581个线性B细胞表位，81个不连续B细胞表位数，这些表位已在同行评审文献中报告。此外，已有320个肽被报道为T细胞表位(表1). 这些表位的绝大多数来源于Betacoronavirues公司，更具体地说，来自严重急性呼吸系统综合征冠状病毒，仅占其中60%以上。就识别各种B和T细胞表位的宿主而言(表2)，大多数表位（B或T）在人类或小鼠系统中定义。值得注意的是，在人类中描述的417个B和T细胞表位中，除2个表位外，其余都来自β冠状病毒其中398人来自SARS-CoV。

表1

IEDB冠状病毒B和T细胞表位清单

表位集合类型冠状病毒
总计
阿尔法贝塔
伽马射线
SARS-CoV公司MERS-CoV公司其他
B电池构象的18272321181
线性的8140556030581
T细胞61164255416320

表2

IEDB冠状病毒B和T细胞表位清单

表位集合主机冠状病毒b条
总计
阿尔法贝塔
伽马射线
SARS-CoV公司MERS冠状病毒其他
B电池一人类03061600322
老鼠6215495820303
其他421425623218
Tg小鼠000000
T细胞人类29201095
老鼠169925531194
其他461001562
Tg小鼠02900029
一B细胞包括构象外延和线性外延。
b条总计介于表1和​和22可能不相等，因为在多个物种中识别出几个表位。

SARS-CoV-2与其他β冠状病毒的相似性

将一致的SARS-CoV-2蛋白序列与SARS-CoV、MERS-CoV和bat-SL-CoVZXC21的序列进行比较，发现SARS-CoV-2、bat-SL-CoVZXC21和SARS-CoV之间存在高度相似性（以%的一致性表示），但与MERS-Co V的相似性更有限(图1). 这与最近于2020年2月7日发表的一篇论文一致，该论文显示SARS-CoV-2与SARS或SARS-like CoV之间的相似性最高(Wu等人。，2020). 此外，严重急性呼吸系统综合征冠状病毒是与严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2型最相关的病毒，在人类（和其他物种）中已经定义了大量的表位，它也会导致人类疾病并导致致命后果。因此，在接下来的分析中，我们重点比较已知的SARS-CoV表位序列与SARS-CoV-2序列。

我们首先评估了SARS-CoV衍生表位的分布作为来源蛋白的功能(表3). 在B细胞反应的背景下，SARS-CoV蛋白质组中的12种抗原大多数与表位相关，其中最多的来自棘突糖蛋白、核蛋白和膜蛋白(表3). 与其他蛋白质相关的B细胞表位的缺乏可能是因为，平均而言，迄今为止的B细胞抗原表位筛选研究已探查了构成每个序列不到20%的区域，包括不到1%的Orf 1ab多聚蛋白。通过比较，至少在一定程度上已经在B细胞分析中探索了棘突糖蛋白、核蛋白和膜蛋白序列的完整跨度。

表3

IEDB冠状病毒B和T细胞表位清单

SARS-CoV蛋白质类B电池T细胞
刺突糖蛋白27948
核蛋白11333
膜蛋白204
复制酶多蛋白1ab89
蛋白质3a27
包膜小膜蛋白20
非结构蛋白3b20
蛋白质7a20
蛋白质9b20
非结构蛋白610
蛋白质非结构8a10

T细胞表位总数包括在人类和/或转基因小鼠中识别的表位。

在T细胞表位的情况下也观察到类似的情况。在这里，我们只考虑了识别受人类白细胞抗原（HLA）主要组织相容性复合体（MHC）限制的表位，因为MHC多态性通常导致人类和小鼠识别不同的表位。

定义SARS-CoV基因组中的免疫显性区域

使用IEDB的免疫浏览器工具将SARS-CoV衍生的B细胞表位映射回SARS-CoV参考序列(Dhanda等人。，2018). 该工具结合了参考序列上的所有可用记录，并产生了反应因子（RF）评分，该评分说明了阳性率（在阳性表位中发现残基的频率）和记录数量（报告了多少独立检测）。考虑到RF得分≥0.3的残基延伸，确定优势区域。

峰糖蛋白、膜蛋白和核蛋白的分析如所示图2对于棘突糖蛋白(图2A） ，我们确定了五个可能感兴趣的区域（残基274–306、510–586、587–628、784–803和870–893），所有这些区域都与高免疫应答率相关。其中三个免疫优势区位于CTD2和CTD3（C末端结构域）的S1亚单位，而其他两个位于S2亚单位的HR1结构域。

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基于SARS特异性表位定位的B细胞免疫优势区

计算每个氨基酸位置的RF得分（参见STAR方法)并绘制了棘突糖蛋白（A）、膜蛋白（B）和核蛋白（C）的SARS-CoV共识序列。

接下来，我们将SARS-CoV B细胞表位区序列与SARS-CoV-2序列进行比对，以计算SARS-CoV.优势区与SARS-CoV-2之间的一致性百分比(表4). 在确定的10个区域中，6个区域与SARS-CoV-2的同源性达到或超过90%，2个区域的同源性在80%-89%之间，2个地区的同源性较低，但仍有可观的同源性（69%和78%）。

表4

严重急性呼吸系统综合征冠状病毒B细胞显性表位区

SARS-CoV公司
SARS-CoV-2型
顺序最大RF顺序蛋白质一映射的开始-结束身份（%）
DAVDCSQNPLAELKCSVKSFEIDKGIYQTSNF公司0.504DAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSN公司S公司287–31769
VCGPKLSTDLIKNQCVNFNGLTGTGVLTPSSKRFQPFQFQFGRDVSFTDSVRDPKTSEILDISPCSFGGVSVIT0.745VCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVI公司S公司524–59880
GTNASSEVAVLYQDVNCTDVDVSTAIHADQLTPAWRIYSTGNN公司0.709天然气天然气天然气天然气天然气天然气天然气天然气天然气天然气天然气天然气天然气天然气天然气天然气天然气天然气天然气天然气天然气天然气天然气天然气天然气天然气天然气天然气天然气天然气天然气天然气天然气天然气S公司601–64078
FSQILPDPLKPTKRSFIED公司0.365FSQILPDPSKRSFIE公司S公司802–81989
FGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIG公司0.367FGAGAALQIPFAMQMAYRFNGI公司S公司888–909100
MADNGITVEELKQLLEQWNLVIG公司0.460MADSNGTITVEELKKLLEQWNLVI公司M（M）1–2492
PLMESELVIGAVIERGHLRMA公司0.457PLLESELVIGAVILRGHLRI公司M（M）132–15190
PQGLPNNTASWFTALTQHGKEE公司0.537RPQGLPNNTASWFTALTQHGK公司N个42–6295
NNAATVLQLPQGTTLPKGFYA公司0.543NNNAATVLQLPQGTTLPKGF公司N个153–17295
KHIDAYKTFPPTEPKKDKKKKTDEAQPLPQRQKKQPTVTLLPAADMDD公司0.82日期日期日期日期日期日期日期日期日期日期日期日期日期日期日期日期日期日期日期日期日期日期日期日期日期日期日期日期日期日期日期日期日期日期日期日期日期日期日期日期日期日期日期日期日期日期日期日期日期日期日期日期日期日期日期日期日期日期日期日期日期日期日期日期日期日期日期日期日期日期日期日期日期日期日期日期日期日期日期日期日期日期日期日期日期日期日期日期日期日期日期日期日期日期日期日期日期日期日期日期日期日期日期日期日期日期日期日期日期日期日期日期日期日期日期日期N个355–40190

S、 表面糖蛋白；M、 膜蛋白；N、 核衣壳磷酸蛋白

在类似的分析中，也发现T细胞表位主要与棘突糖蛋白和核蛋白相关(表3).表5显示了迄今为止在人类中发现的最主要的SARS-CoV个体表位列表。我们还对SARS-CoV T细胞表位序列进行了比对，并计算了每个表位与SARS-CoV-2的同源性百分比。对于每个T细胞表位，表5显示了来源抗原、表位序列、同源SARS-CoV-2序列以及相应的序列一致性百分比。总的来说，核衣壳磷酸蛋白和膜衍生表位最为保守（分别为8/10和2/3，与SARS-CoV-2的同源性≥85%）。Orf1ab和表面糖蛋白表位中度保守（分别为3/7和10/23，与SARS-CoV-2的同源性≥85%），Orf3a表位最不保守。

表5

优势SARS-CoV T细胞表位

非典
SARS-CoV-2型
顺序射频分数HLA限制一顺序蛋白质映射的开始-结束身份（%）
VRGWVFGSTMNNKSQSVI公司0.15DRB1（DRB1）∗04:01IRGWIFGTTLDSKTQSLL公司S公司101–11850
CTFEYISDAFSLD公司0.21DRB1（DRB1）∗04:01CTFEYVSQPFLMD公司S公司166–17862
DAFSLDVSEKSGN公司0.62DRB1（DRB1）∗04:01QPFLMDLEGKQGN公司S公司173–18538
TNFRAILTAFSPAQDIW公司0.32DRB1（DRB1）∗04:01TRFQTLLALHRSYLTPGDSGW公司S公司236–25817
KSFEIDKGIYQTSNFRV公司0.40DRB1型∗04:01，DRB1∗07:01KSFTVEKGIYQTSNFRVQ公司S公司304–32178
STFFSTFKCYGVSATKL公司0.50DRB1（DRB1）∗DR8，07:01SASFSTFKCYGVSPTKL公司S公司371–38782
KLPDDFMGCV公司0.55A类∗02:01KLPDDFTGCV公司S公司424–43390
NIDATSTGNYNYKYRYLR公司0.29II类NLDSKVGGNYNYLYRLFR公司S公司440–45756
YLRHGKLRPFERDISNVP公司0.16DRB1（DRB1）∗04:01YLYRLFRKSNLKPFERDI公司S公司451–46858
RPFERDISNVPFS公司0.36DRB1（DRB1）∗04:01KPFERDISTEIYQ公司S公司462–47454
KSIVAYTMSLGADSSIAY公司0.15DRB1（DRB1）∗04:01，DRB1∗07:01QSIIAYTMSLGAENSVAY公司S公司690–70772
SIVAYTMSL公司0.29A类∗02:01SIIAYTMSL公司S公司691–69989
TECANLLLLQYGSFCTQL公司0.50DR8（数字参考8）技术S公司747–76394
VKQMYKTPTLKYFGGFNF公司0.20DRB1（DRB1）∗04:01VKQIYKTPPIKDFGFNF公司S公司785–80278
ESLTTTSTALGKLQDVV公司0.42DRB1（DRB1）∗04:01DSLSSTASALGKLQDVV公司S公司936–95271
ALNTLVKQL公司0.29A类∗02时01分ALNTLVKQL公司S公司958–966100
VLNDILSRL公司0.29A类∗02:01VLNDILSRL公司S公司976–984100
LITGRLQSL公司0.42A类∗02:01LITGRLQSL公司S公司996–1004100
QLIRAAEIRASANLAATK公司0.20DRB1（DRB1）∗04时01分QLIRAAEIRASANLAATK公司S公司1011–1028100
SWFITQRNFFSPQII公司0.60DRB1（DRB1）∗04:01HWFVTQRNFYEPQIIS公司1101–111573
RLNEVAKNL公司0.42A类∗02:01RLNEVAKNL公司S公司1185–1193100
NLNESLIDL公司0.29A类∗02:01NLNESLIDL公司S公司1192–1200100
菲亚格利亚四世0.80A类∗02:01菲亚格利亚四世S公司1220–1228100
RFFTLGSITAQPVKI公司0.18B类∗58:01RIFTIGTVTLKQGEI公司奥尔夫3a6–2040
西塔克普韦基0.29B类∗58:01TVTLKQGEI公司奥尔夫3a12–2022
TLACFVLAAV型0.59A类∗02:01TLACFVLAAV型M（M）61–70100
GLMWLSYFV公司0.59A类∗02:01GLMWLSYFI公司M（M）89–9789
HLRMAGHSL公司0.40I类HLRIAGHHL公司M（M）148–15678
阿尔NTPKDHI0.29A类∗02:01阿尔NTPKDHIN个138–146100
LQLPQGTTL公司0.29A类∗02:01LQLPQGTTL公司N个159–167100
盖塔勒尔0.38B类∗40:01GDAALALLLL公司N个215–22480
法律日程表0.29A类∗02:01法律日程表N个219–227100
LLLDRLNQL公司0.42A类∗02:01LLLDRLNQL公司N个222–230100
rlnxleskv公司0.42A类∗02:01RLNQLESKM公司N个226–23489
TKQYNVTQAF公司0.29I类TKAYNVTQAF公司N个265–27490
GMSRIGMEV公司0.42A类∗02:01GMSRIGMEV公司N个316–324100
MEVTPSGTWL公司0.42B类∗40:01MEVTPSGTWL公司N个322–331100
QFKDNVILL公司0.50A类∗24:02NFKDQVIIL公司N个345–35378
CLDAGINYV公司0.42A类∗02:01克利斯福尼奥尔夫1ab2139–214756
WLMWFIISI公司0.42A类∗02时01分WLMWLINL公司奥尔夫1ab2292–230067
ILLLDQVLV公司0.42A类∗02:01伊利诺伊州奥尔夫1ab2498–250689
LLCVLAALV公司0.42A类∗02:01SACVLAAEC公司奥尔夫1ab2840–284856
ALSGVFCGV公司0.42A类∗02:01SLPGVFCGV公司奥尔夫1ab2942–295078
TLMNVITLV公司0.42A类∗02:01TLMNVLTLV型奥尔夫1ab3639–364789
SMWALVISV公司0.42A类∗02:01斯姆瓦利斯夫奥尔夫1ab3661-366989

S、 表面糖蛋白；M、 膜蛋白；N、 核衣壳磷酸蛋白。

一仅在HLA转基因小鼠中定义的限制用斜体字表示。

SARS-CoV-2 B细胞表位的预测

为了通过另一种方法定义潜在的B细胞表位，我们使用了IEDB提供的预测工具。使用SARS-CoV-2表面糖蛋白、核衣壳磷酸蛋白和膜糖蛋白序列进行B细胞表位预测，如上所述，这些序列被发现是B细胞对其他冠状病毒反应的主要蛋白靶点。同时，我们用Bepipred 2.0对线性B细胞表位进行了预测(Jespersen等人。，2017)和Discotope 2.0的构象表位(Kringelum等人。，2012). IEDB B单元预测工具页面上提供了这两种预测算法(http://tools.iedb.org/main/bcell/). 每个蛋白质每个氨基酸位置的B细胞表位预测结果的完整列表见表S1.

使用Bepipred 2.0和≥0.55的临界值（对应于80%的特异性临界值）(Jespersen等人。，2017)表面糖蛋白预测的B细胞表位数量最多，其次是膜糖蛋白和核衣壳磷蛋白(表S2). 为了预测和绘制构象B细胞表位，我们使用了最近提交的SARS-CoV-2棘突糖蛋白结构（PDB：6VSB型). 基于Discotope 2.0算法的分析，表面糖蛋白氨基酸位置的列表很可能包含在预测的B细胞表位中，如所示表S1（截止值≥−2.5，对应80%的特异性）。然后，我们将相关氨基酸定位到模型结构上，从而可以识别表面糖蛋白中的七个预测表位残基/区域（491-505、558-562、703-704、793-794、810、914和1140-1146）(图3).

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SARS-CoV-2尖峰糖蛋白（PDB:6VSB型)

根据Discotope 2.0进行的排序，预测为B细胞表位的前13个氨基酸残基的计算表面以红色显示。单体显示在左上角。右上和下中心以两个不同的方向呈现三聚体。使用YASARA进行三维重建(Krieger和Vriend，2014年).

SARS-CoV-2 T细胞表位的预测

为了预测CD4 T细胞表位，我们使用了Paul和合著者描述的方法(Paul等人。，2015年a)，在IEDB的Tepitool资源中实现(Paul等人。，2016). 该方法被设计并验证为独立于种族和HLA多态性预测显性表位，利用不同HLA II类基因座和等位基因变体之间广泛的交叉反应性和库重叠。在这里，我们选择了共识百分比中位数≤20的肽，这是一个与表位面板相关的阈值，负责大约50%的靶向特异性反应。使用该阈值，我们确定了SARS-CoV-2序列中的241个候选基因（参见表S3).

在之前的实验中，我们表明基于相似肽数的池可以通过顺序冻干生成(Carrasco Pro等人。，2015). 这些肽库（或巨库）包含预测或实验验证的表位，并允许测量人类T细胞反应在传染病适应症中的程度和表型特征，例如百日咳杆菌,结核分枝杆菌登革热和寨卡病毒(Carrasco Pro等人。，2015,da Silva Antunes等人。，2018,Grifoni等人。，2017,Grifoni等人。，2018). SARS-CoV-2 CD4巨库涵盖所有10种预测蛋白质，潜在表位的数量与每个蛋白质的大小成正比(表S4).

同时，我们还试图确定可能的CD8表位。这里需要一种不同的方法，因为不同HLA I类等位基因变体和位点之间的重叠更局限于特定的等位基因群或超型(Sidney等人。，2008). 遵循先前验证的方法(Weiskopf等人。，2013)，我们收集了一组12个最显著的HLA I类等位基因，这些等位基因已被证明能够广泛覆盖普通人群，如STAR方法（另请参见表S5). 然后，我们使用Net-MHC pan 4.0 EL算法进行HLA I类绑定预测(Jurtz等人。，2017)IEDB提供。对于每个等位基因，我们选择了SARS-CoV-2序列中得分最高的1%肽，根据预测进行排名。在消除冗余和嵌套肽后，我们得到了最终的“生物信息学“628个独特预测表位的百万宝库。表S6列出了每个蛋白质的独特预测表位，指出了每个蛋白质各自的HLA限制。

两种不同方法识别的表位之间的对应关系

通过与实验定义的SARS-CoV表位同源性鉴定的表位表4和​和55然后与表位预测确定的表位进行比较表S2,第3章、和S6系列两种方法中独立鉴定的表位被认为是最有价值的先导。

我们首先比较了SARS-CoV中确定的B细胞免疫优势区，并将其映射到同源的SARS-CoV-2蛋白(表4)，与预测的线性(表S2)和构象(表S1)B细胞表位。在SARS棘突糖蛋白映射到SARS-CoV-2的五个B细胞免疫优势区中，三个区域与BebiPred 2.0识别的区域重叠，两个区域与Discotope 2.0预测的区域重叠(图3;表S1). 映射到SARS-CoV-2的SARS-CoV膜蛋白和核蛋白的五个区域与BebiPred 2.0预测的区域没有重叠。如上所述，对于这两种蛋白质，没有Discotope 2.0预测可用。

基于SARS-CoV-2棘突糖蛋白PDB结构的Discotope 2.0预测分析独立确认了根据SARS-CoV数据定义的两个可能的表位区域。具体来说，一个显性表位对应于来自表5，与558–562预测表位重叠，并且还预测了802–819区域（比照，预测的810残基位于该区域的中间）。最后，888–909区域被漏掉了，因为预测的残基914正好位于表位之外。

当我们比较映射到SARS-CoV-2的SARS-CoV T细胞表位时(表5)具有预测的CD4和CD8 T细胞表位(表S3和S6系列我们发现，在17个SARS-CoV-2 T细胞表位中，有12个表位与SARS-CoV具有高序列同源性（≥90%），通过这两种方法独立鉴定。两种方法还鉴定了16个表位中的7个表位具有中等序列一致性（70%–89%），12个表位中低序列一致性的6个表位（<70%）。鉴于实验数据来源于一组扭曲的HLA限制（主要是HLA a），缺乏绝对对应性并不奇怪∗02:01），我们的HLA I类预测策略针对的是一组更有限的等位基因，这些等位基因被选为代表世界上最常见的变异；同时，II类预测预计将涵盖50%的II类响应(Paul等人。，2015年b).

讨论

本研究确定了人类对SARS-CoV-2免疫应答的可能靶点，包括适应性免疫应答的B和T细胞臂。面对围绕新冠肺炎日益增长的医疗和社会紧迫性，尤其是考虑到目前缺乏任何相应免疫反应的实验数据，这一点非常重要。我们采用的方法是基于建立几条证据线，明确指出SARS-CoV是一个相关模型，以推断SARS-CoV-2（与新冠肺炎相关的病毒）应答的可能靶点。

第一条证据表明，在已知感染人类的冠状病毒中，SARS-CoV在系统发育方面与SARS-CoV-2最为相似。第二条证据是，SARS-CoV-2在序列一致性水平上与SARS-CoV最相似（且高度相似）。第三，当我们批判性地回顾与冠状病毒环境下适应性反应识别的精确表位相关的知识时，很明显，迄今为止在人类中描述的417个B和T细胞表位中，除2个表位外，其余表位均来自β冠状病毒其中398人来自SARS-CoV。

我们的分析表明，某些SARS-CoV区域是B细胞应答的主要区域，并且这些区域与SARS-CoV-2的序列非常保守。SARS恢复期血清中五个区域含有中和抗体识别的表位(郭等人。，2004,Shichijo等人。，2004). 其中，特别令人感兴趣的是嵌套604−625肽的587–628区域，该肽在一名SARS恢复期患者中被发现，并被发现有能力引发抗体，从而有效预防非人灵长类动物的感染(Hu等人。，2005,Wang等人。，2016).

从膜蛋白中鉴定出两个区域（1–25和131–152）(图2B） ，并确定了核蛋白的三个区域（43–65、154–175和356–404）(图2C） ●●●●。膜蛋白中的这两个区域已被证明能引起显著的IgM和IgG反应和广泛的识别，突出显示它们是潜在的诊断候选区域(Chow等人。，2006,Wang等人。，2003). 在核蛋白中确定的三个区域中，156-175对SARS患者血清表现出较强的反应性，并在多种物种中表现出免疫原性，包括小鼠、猴子和人类(Liu等人。，2006).

由于SARS-CoV和SARS-CoV-2的序列总体上高度相似，我们推断，SARS-CoV中占优势的区域很可能也占优势，即使实际序列不同。这一假设与SARS-CoV-2棘突糖蛋白的最新冷冻电子显微镜（croEM）结构相一致，表明其整体结构与SARS-CoV棘突蛋白高度相似(Wrapp等人。，2020). 然而，在同一项研究中，作者没有观察到严重急性呼吸系统综合征冠状病毒单克隆抗体与严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2型的交叉识别。事实上，他们观察到与识别SARS-CoV-2棘突受体结合域（RBD）的SARS-CoV抗体没有反应，尽管SARS-CoV2保留了与SARS-CoVACE2受体结合的相同能力(Wrapp等人。，2020). 这表明对RBD域进行的B细胞预测需要进一步研究。

我们还分析了SARS-CoV T细胞表位。在这些情况下，表位区域和单个表位更广泛地分布在各个蛋白质中，这使得识别离散的、占优势的表位区域更加困难。鉴于T细胞能够识别病毒抗原的细胞加工过程中产生的短肽，而这些短肽可以从蛋白质的任何片段中提取，因此这种结果并不意外。

通常预计CD8 T细胞表位将来自结构蛋白和非结构蛋白(Tian等人。，2019)因为这两种蛋白质都是由受感染的细胞内源性处理的。在II类表位的情况下，结构蛋白特别有趣，因为它们很可能通过同源相互作用提供帮助(Sette等人。，2008). 当检查SARS-CoV的同源区域时，已经发现可能的T细胞表位在诸如ELISPOT、细胞内染色（ICS）和多聚体/四聚体染色的测定中是阳性的（例如。，Cheung等人。，2007,Cheung等人。，2008,Kohyama等人。，2009,Tsao等人。，2006,Yang等人。，2009).

我们还试图通过一种完全不同的方法来处理潜在的SARS-CoV-2表位，即利用IEDB主持的表位预测(Dhanda等人，2019年,Vita等人。，2019). 对于B细胞表位，我们使用了预测线性表位的方法(Jespersen等人。，2017)以及最近获得可靠结构的棘突糖蛋白(Wrapp等人。，2020)，迪斯科2.0(Kringelum等人。，2012)该方法还基于蛋白质构象和残基暴露预测表位。盘区预测独立地确认了根据SARS-CoV数据定义的两个可能的表位区域。

对于T细胞表位，我们使用了预测算法(Jurtz等人。，2017,Paul等人。，2016)绘制数百个潜在的人类抗原表位，以解释HLA多态性，以及T细胞抗原表位通常来源于结构和非结构蛋白质，且不限于暴露区域。在这里，作为预测的独立验证，我们询问预测是否有效地识别了SARS-CoV中实验确定的、受人类HLA限制的、在SARS-CoV-2中保守的相对较少的表位。事实上，我们发现在17个SARS-CoV-2 T细胞表位中，有12个表位与SARS-CoV具有高序列同源性（≥90%），这些表位通过基于SARS-CoV-2序列的表位预测独立识别。

总之，将与SARS-CoV表位相关的可用信息与生物信息学预测结合使用，可以发现SARS-CoV-2的特定区域很可能被人类免疫应答识别。观察到SARS-CoV-2和SARS-CoV之间的许多B和T细胞表位高度保守是很重要的。设计用于针对这些保守表位区域的免疫反应的疫苗接种策略可以产生不仅具有交叉保护作用的免疫Betacorona病毒但对正在进行的病毒进化也有相对抵抗力。

STAR公司★方法

关键资源表

试剂或资源来源标识符
存放的数据
SARS-CoV-2棘突糖蛋白3D-结构Wrapp等人。，2020PDB编号：6VSB型
武汉Hu-1 RNA分离物NCBI核数据库GenBank（基因银行）：姆恩908947
ORF10蛋白NCBI蛋白质数据库NCBI公司：YP_009725255.1型
核衣壳磷蛋白NCBI蛋白质数据库NCBI公司：YP_009724397.2型
ORF8蛋白NCBI蛋白质数据库新冠肺炎双抗体：YP_009724396.1型
ORF7a蛋白NCBI蛋白质数据库NCBI公司：YP_009724395.1型
ORF6蛋白NCBI蛋白质数据库NCBI公司：YP_009724394.1型
膜糖蛋白NCBI蛋白质数据库NCBI公司：YP_009724393.1型
包膜蛋白NCBI蛋白质数据库NCBI公司：YP_009724392.1型
ORF3a蛋白NCBI蛋白质数据库新冠肺炎双抗体：YP_009724391.1型
表面糖蛋白NCBI蛋白质数据库NCBI公司：YP_009724390.1型
orf1ab多蛋白NCBI蛋白质数据库NCBI公司：YP_009724389.1型
软件和算法
亚萨拉Krieger和Vriend，2014年http://www.yasara.org
国际能源数据库Vita等人。，2019https://www.iedb.org
BebiPred 2.0版Jespersen等人。，2017http://tools.iedb.org/bcell/
迪斯科2.0Kringelum等人。，2012http://tools.iedb.org/bcell/
NetMHCpan EL 4.0公司Jurtz等人。，2017http://tools.iedb.org/mhci/
Tepitool公司Paul等人。，2016http://tools.iedb.org/tepitool网站/

主要联系人和材料可用性

请联系A.S(alex@lji.org)用于本研究中确定的合成肽组的等分。由于成本和数量有限，肽试剂的可用性受到限制。

方法详细信息

冠状病毒T和B表位的IEDB分析

2020年1月底，通过搜索IEDB，确定了冠状病毒的T和B细胞表位。广泛查询冠状病毒（分类ID no.11118），选择T细胞、B细胞和/或配体背景下的阳性检测。将每个独特表位的特征（即物种、种源蛋白、阳性检测类型、MHC限制性），以及在B或T细胞检测中检测到的供体总数和相应的阳性反应供体总数，以及作为宿主的函数制成表格。最后，广泛计算T或B细胞化验特定反应频率分数（RF）（即任何宿主），或针对特定环境计算（如人类T细胞化验）。具体来说，RF=[（r–sqrt（r）]/t，其中r是响应捐赠者的总数，t是测试的捐赠者总数(Carrasco Pro等人。，2015)).

使用IEDB Immunobrowser工具可视化SARS-CoV（税号694009）序列表位密度(Dhanda等人。，2018). 为了识别相邻的优势区域，重新计算每个残基的RF分数，以表示一个滑动的10残基窗口。

冠状病毒序列与SARS-CoV-2的比较

从ViPR中检索SARS-CoV和MERS-CoV的所有全长蛋白序列(https://www.viprbrc.org/brc/home.spg？装饰=corona)2020年1月31日。为了排除实验菌株的序列，分析中排除了“未知”小鼠和猴宿主的序列。使用ViPR中的MUCLE算法对剩余序列进行比对。在计算最终比对之前，删除了初步分析中导致比对不良的序列。使用ViPR中的序列变异分析工具从最终比对中确定每个病毒组的一致性蛋白质序列。选择序列与SARS-CoV和MERS-CoV一致的天然病毒分离物的蛋白质序列用于表位序列分析。

SARS-CoV-2序列保守性的测定

每个武汉-胡-1（基因银行：MN908947号)使用BLAST算法（ViPR；https://www.viprbrc.org/brc/blast.spg？method=ShowCleanInputPage&amp;装饰器=电晕)计算武汉Hu-1蛋白与其比较靶点之间的配对一致性。

SARS-CoV-2 B细胞表位预测

对三种不同的冠状病毒蛋白进行了线性B细胞表位预测：表面糖蛋白（S）、核衣壳磷蛋白（N）和膜糖蛋白（M）（NCBI：YP_009724390.1型,YP_009724397.2型和YP_009724393.1型这些蛋白的同源版本是SARS-CoV B细胞免疫应答的主要靶点。我们使用了BebiPred 2.0(Jespersen等人。，2017)IEDB中可用的B细胞预测分析工具中嵌入的算法(Zhang等人。，2008). 对于每种蛋白质，检索每种氨基酸的表位概率得分和暴露概率。使用0.55的临界值预测潜在的B细胞表位（对应于特异性大于0.81，敏感性小于0.3），并考虑到序列具有7个以上氨基酸残基。使用Discotope 2.0进行基于结构的抗体预测(Kringelum等人。，2012)，在IEDB中可用(Zhang等人。，2008)使用SARS-CoV-2棘突糖蛋白结构（PDB ID：6VSB型).

SARS-CoV-2 T细胞表位预测

利用为参考SARS-CoV-2分离物武汉-Hu-1预测的10个蛋白质进行表位预测。相应的蛋白质登录标识号为：NCBI：YP_009725255.1型（Orf 10），NCBI：YP_009724397.2型（N） ，NCBI：YP_009724396.1型（Orf 8），NCBI：YP_009724395.1型（Orf 7a），NCBI：YP_009724394.1型（Orf 6），NCBI：YP_009724393.1型（M） 、NCBI：YP_009724392.1型（包膜蛋白，E），NCBI：YP_009724391.1型（Orf 3a），NCBI：YP_009724390.1型（S） 和NCBI：YP_009724389.1型（Orf 1ab）。

对于CD4 T细胞表位预测，我们应用了一种先前描述的算法，该算法用于预测显性HLA II类表位，建议使用预测临界值≤20的中位共识百分位(Paul等人。，2015年b). 为了预测CD8 T细胞表位，我们选择了全球人群中12个最常见的HLA I类等位基因(Middleton等人。，2003,Paul等人。，2013)使用表型频率截止值≥6%。包括的特异性等位基因为：HLA-A∗01:01，HLA-A∗02:01，HLA-A∗03:01，HLA-A∗上午11:01∗23:01，HLA-A∗24:02，HLA-B∗07:02，HLA-B∗08:01，HLA-B∗35:01，HLA-B∗40:01，HLA-B∗44:02，HLA-B∗44:03. 使用NetMHCpan EL 4.0算法和8-14个基因的大小范围对这组等位基因运行SARS-CoV-2蛋白序列(Jurtz等人。，2017). 对于分析的每个HLA I类等位基因，我们根据预测得分选择排名前1%的表位。为了生成最终的合成集，在为每个区域分配多个相应的HLA限制之前，将重复肽（即为多个等位基因选择的肽）减少到一次出现，并将嵌套肽隐藏在更长的序列中，长度可达14个残基。

量化和统计分析

根据已发表文献和公开可用数据库中的数据，本理论研究未使用统计分析。按照上述方法细节中的描述计算%同一性和反应因子得分。

数据和代码可用性

如前所述，本研究中呈现和分析的所有数据均来自IEDB和PDB。发表的文章包括本研究期间生成或分析的所有数据，并在随附的表格、图表和补充材料从IEDB下载的数据文本文件可根据要求从相应作者处获得。

致谢

我们感谢埃里卡·奥尔曼·萨普希尔（Erica Ollmann Saphire）、莎伦·申德尔（Sharon Schendel）和米切尔·克罗恩贝格（Mitchell Kronenberg）对手稿的批判性阅读以及许多有益的建议。我们还感谢Jason McLellan和Barney Graham尽早获得SARS-2棘突糖蛋白的PDB结构。对这项工作的支持包括通过NIH-NIAID合同75N9301900065（A.S.）和75N930109C00001（A.S.和B.P.）提供的资金。NIH-NIAID合同75N93019C00076（Y.Z.和R.H.S.）提供了额外支持。

作者贡献

A.G.、J.S.和Y.Z进行了分析并撰写了论文；R.H.S.撰写了这篇论文，并为病毒分析提供了方向；B.P.构思了该项目，撰写了论文，并为生物信息成分提供了专业知识；A.S.构思了该项目，撰写了论文，并为研究提供了总体指导。

利益声明

La Jolla免疫学研究所（LJI）已就该手稿提交了专利申请。

笔记

发布日期：2020年3月16日

脚注

补充信息可在网上找到https://doi.org/10.1016/j.chom.2020.03.002.

补充信息

文件S1。表S2、S4和S5：
单击此处查看。（187K，pdf）

表S1。SARS-CoV-2 B细胞表位预测，与图3和STAR方法相关：
单击此处查看。（205K，xlsx）

表S3。严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2型CD4预测表位，与STAR方法相关：
单击此处查看。（28K，xlsx）

表S6。SARS-CoV-2 CD8预测表位，与STAR方法相关：
单击此处查看。（61K，xlsx）

文件S2。文章及补充信息：
单击此处查看。（210万，pdf）

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