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前部生理学。2018; 9: 542.
2018年5月16日在线发布。 数字对象标识：10.3389/fphys.2018.00542
PMCID公司：项目编号：5964359
采购管理信息：29867579

产前脂多糖暴露促进雄性后代大鼠血脂异常

于世云,1,† 阎文,1,2,† 李京梅,1 张海刚,三和亚柳（Ya Liu）1,*
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

关联数据

补充资料

摘要

炎症对心血管疾病的发病机制至关重要。我们已经发现脂多糖（LPS）诱导的宫内炎症会增加成年后代大鼠的CVD。本研究旨在探讨产前接触脂多糖对雄性后代大鼠血脂谱的影响，并进一步评估其对高脂饮食（HFD）的敏感性。母体LPS（0.79 mg/kg）暴露导致8周龄仔鼠血清和肝脏总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇、天冬氨酸氨基转移酶水平显著升高，肝脏形态异常。同时，发现参与肝脏脂质代谢和相关信号通路的基因表达受到干扰，特别是超低密度脂蛋白受体（VLDLR）上调和跨膜7超家族成员2（TM7SF2）下调。然而，在HFD治疗后，与仅接受产前LPS暴露治疗的后代相比，血脂谱改变和肝功能障碍加剧。与对照子代相比，仅用HFD处理的子代大鼠的肝线粒体（Mt）表现出显著的ATP水平升高、复合物IV表达增强和活性急剧降低，而用LPS处理的母鼠的子代表现出ATP含量减少、膜电位降低、，线粒体呼吸复合体IV蛋白表达和活性下降，MtDNA缺失水平也增加。此外，HFD治疗使产前接触LPS的子代大鼠的线粒体疾病恶化。综上所述，母亲接触LPS会加剧成年后代HFD引起的血脂异常，这应该与线粒体异常和胆固醇代谢基因表达紊乱有关。

关键词：宫内环境、炎症、后代、血脂异常、线粒体

介绍

心血管疾病（CVD）是世界范围内的主要死亡原因。尽管在生活方式改变和药物治疗方面取得了最新进展，但在所有可改变的危险因素中，血脂异常确实是导致CVD发生的最大因素。值得注意的是，根据美国国家健康和营养检查调查（NHANES）（Pencina等人。，2014; Kit等人。，2015). 越来越多的流行病学证据表明，导致成人CVD的风险轨迹可能在出生后早期或出生时就已经存在，而成年早期的高脂血症会增加冠心病的长期风险（Barker，2004; 克利尔等人。，2007; Navar-Boggan等人。，2015). 因此，人们主要关注心血管疾病的发展起源和心血管风险的早期决定因素。

炎症是CVD发病机制的核心，并在一定程度上调节传统危险因素的影响（Libby，2012; Golia等人。，2014). 以慢性炎症为特征的疾病，如系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎和克罗恩病，据报道与加速CVD发病有关（Gkaliagkousi等人。，2012; Hong等人。，2015; Bacchiega等人。，2017). 此外，急性冠脉综合征患者的炎症标记物水平升高（Libby等人。，2014). 研究表明，母亲经历的炎症在怀孕期间非常常见，如牙周和泌尿道炎症，或呼吸道感染，甚至空气污染，母亲肥胖，然而，在胎儿发育的背景下，它们通常被忽视（Seaton等人。，1995; Ramsay等人。，2002). 由于母亲发炎，胎儿可能会通过胎盘循环接触到来自母亲的细胞因子、趋化因子和/或脂质介质水平升高。因此，早期的炎症事件可能在以后CVD易感性的规划中起着关键作用。最近，我们开发了一种特征鲜明的妊娠期由脂多糖（LPS）或酵母菌多糖诱导的母体非细菌性炎症大鼠模型，该模型在6周龄时就显示出子代大鼠血压升高，而且血压随着年龄的增长而逐渐升高（Wei等人。，2007; Hao等人。，2010年a). 此外，12周龄的后代表现出与动脉粥样硬化相关的主动脉早期病理改变（Zhao等人。，2014). 随后，在16周龄和32周龄的后代中分别检测到心肌肥大和心功能不全（Wei等人。，2013). 然而，幼年期LPS攻击对成年子代大鼠血脂谱的作用及其潜在机制尚不清楚。迄今为止，众所周知，线粒体是脂质代谢的主要细胞器。线粒体功能障碍发生在肥胖、胰岛素抵抗和非酒精性脂肪性肝炎（NASH）的背景下（Serviddio等人。，2008; Cheng和Almeida，2014; Fisher-Wellman等人。，2014). 重要的是，线粒体可以为母亲压力导致的成人疾病提供理想的候选机制，因为线粒体是母亲遗传的（Dillin等人。，2002). 在此，我们假设线粒体紊乱可能导致LPS暴露母鼠后代大鼠的脂质异常。

在本研究中，引入了产前LPS暴露的大鼠模型，以解决妊娠期间母体炎症对8周龄后代大鼠血脂谱的影响，并进一步评估成年男性后代对血脂异常和线粒体功能障碍的易感性，这些成年男性后代面临公认的心血管疾病风险因素，包括高脂肪饮食喂养。

材料和方法

动物

从第三军医大学实验动物中心（中国重庆）获得无孕、定时交配的Sprague-Dawley大鼠。所有动物都可以免费享用标准的实验室鼠食和自来水。在分娩前，将大鼠单独安置在恒温（24°C）的房间中，并进行12小时的光-暗循环。幼崽由哺乳期的母亲抚养，直到断奶，然后将它们转移到包含其他三到四只幼崽的笼子中。本研究符合实验动物护理和使用指南由美国国立卫生研究院出版（NIH出版物N个.85–23，1996年修订；http://www.nap.edu/readingroom/books/labrats/index.html). 第三军医大学动物实验伦理委员会批准了该研究方案。

驯化5天后，将怀孕大鼠随机分为2组(n个=8），即对照组和LPS组。这两组大鼠在妊娠第8、10和12天分别腹腔注射生理盐水0.5 ml和0.79 mg/kg LPS（Sigma Chemical，St.Louis，MO，USA），这是胚胎肝发育的重要时间点（Si-Tayeb等人。，2010). 出生后对产仔进行计数和称重。然后将幼崽数减至8只，以确保所有幼崽获得同等营养。新生大鼠由其母亲照顾至4周大。5周龄时，将对照组和LPS组的子代大鼠再次随机分为2组，并分配给对照组（3.85 kcal/g；D12450B；新泽西州新不伦瑞克的研究饮食）或高脂肪鼠食（5.24 kcal/g.；D12492，研究饮食）。两种膳食的组成见补充表1.有饮用水和食物随意在整个研究过程中。在8周龄时，随机选择每组雄性后代进行以下分析。

体重和食物摄入

监测1日龄雄性后代大鼠的体重，随后，在实验期间每周监测体重，并每天手动测量食物摄入量。

血脂、ALT和AST水平及肝脏脂质含量的测定

8周龄时，随机选择每组雄性后代，禁食过夜，并用戊巴比妥钠（50 mg/kg）腹腔注射麻醉。取眼球采集血液，3000×g离心15分钟，然后采集上清液作为血浆样本进行进一步分析。使用AU-2700自动生化分析仪（日本东京奥林巴斯）检测血脂水平，包括总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆甾醇（LDL-C），丙氨酸氨基转移酶（ALT）和天冬氨酸氨基转移酶。根据制造商的方案，使用比色试剂盒分别定量肝脏中TC、HDL-C、LDL-C（Abcam，编号ab65336）和TG（AbcamAb65390）的含量。

组织学分析

固定肝脏切片用苏木精和伊红（H&E）染色，以目视观察脂肪变性和细胞浸润。此外，交替切片用油红O染色以分析脂质积聚。Kleiner评分系统是一种基于特征的半定量评分系统，也用于量化肝脏的组织学变化（Kleiner等人。，2005). 简单地说，将个人得分相加得出活动得分，如下所示：脂肪变性（<5%=0，5%-33%=1，33%-66%=2，>66%=3）；膨胀（无=0，少数=1，突出=2）；小叶炎症（无=0，<2个病灶=1，2-4个病灶=2，>4个病灶=3）。分数小于3表示轻度非酒精性脂肪肝（NAFL），分数为3-4表示中度NAFL，分数为5或更多与非酒精性肝炎（NASH）相关。提供了各组各组织学特征的平均得分。

超级阵列分析

大鼠脂蛋白信号传导与胆固醇代谢RT2-采用Profiler PCR阵列（Qiagen，Cat.No.PARN-080Z）检测孕期母亲接触LPS对84个与脂蛋白转运和胆固醇代谢相关基因表达的影响。简言之，从母体对照组和LPS暴露组正常饮食喂养的8周龄仔鼠的肝脏中分离出总RNA，然后使用实时RT-PCR阵列第一链试剂盒制备cDNA。PCR混合物的总体积为25μl，其中包括12.5μl RT2将来自Qiagen的实时SYBR Green/ROX PCR主混合液、11.5μl双蒸馏水和1μl模板cDNA加载到PCR阵列的每个孔中。根据制造商的协议进行PCR循环。使用比较Ct法对数据进行分析，将原始数据归一化为管家基因，包括β-葡萄糖醛酸酶、次黄嘌呤磷酸核糖转移酶1、热休克蛋白β-1、GAPDH和β-肌动蛋白。同时进行大鼠基因组DNA污染、反转录和阳性PCR对照。

RNA制备和实时逆转录PCR

为了验证超级阵列的结果，如前所述进行了实时PCR分析（Hao等人。，2010年b). 使用的PCR引物由Premier 5.0（Premier Biosoft International，Palo Alto，CA，USA）根据大鼠VLDLR（正向：5′-ATG TGA CAG CTC CCA ATT CC-3′；反向：5′-GCT TTC ATC AGA ACC TTC AC-3′）、大鼠TM7SF2（正向：5'-GCC TCG GTT CCT TTG ACT TC-3′；反向：5′-CCA TTG ACC AGC CAC ATA GC-3）和大鼠β-actin（正向：5′-ACG GTC AGG TCA TCA CTA TCG-3′；反向：5’-GGC ATA GAG GTC TTT ACG GAT G-3′）。

线粒体膜电位测定

使用标准方案从8周龄子代大鼠的肝组织中分离和培养原代肝细胞。细胞用PBS洗涤，用1μM四甲基罗丹明-甲酯-高氯酸盐（TMRM，Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）在37°C的PBS中染色20 min，然后再次洗涤细胞三次。使用GloMax®Discover System（Promega）立即量化相对荧光强度，分别激发548 nm和发射574 nm，结果以%对照表示。

ATP测量

使用ATP检测试剂盒（马萨诸塞州剑桥Abcam）测定肝组织中的ATP含量。按照制造商的说明，使用10毫克快速冷冻组织进行比色分析。ATP含量测量一式两份，并表示为%对照。

线粒体DNA损伤的定量PCR

如前所述，检测到线粒体DNA 4977-bp常见缺失，并进行了修改（Partridge等人。，2007). 使用引物生成PCR产物，以识别235-bp对照产物和300-bp产物，其跨度相当于人类常见4977-bp缺失的大鼠。简言之，使用DNAZol检测试剂盒（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）从肝组织样品中提取DNA，并通过光谱法进行定量。PCR产物最初是使用通用引物生成的，以确定是否存在对照和“常见”4977-bp缺失的人类等效物侧翼区域。对产物进行凝胶提取、测序，并根据这些序列设计qPCR引物。控制：正向：5′-CCT CCC ATT CAT TAT CGC CGC CCT TGC-3′，反向：5′-GTC TGG GTC TCC TAG GTC TGG GAA-3′。引物产生235 bp的片段。设计的突变体引物包含预测的断点：正向：5′-AAA ATC CCC GCA AAC GAC CAC CC-3′，反向：5′-GGC AAT TAA GAG TGG GAT GGA GCC AA-3′，产生300-bp的产物。BLASTn对这两个序列进行了筛选，以消除大鼠核基因组中的潜在冗余。他们还根据NCBI SNP数据库和日本线粒体SNP数据库进行筛选。在以下条件下，使用QPK-201 SYBR Green PCR Master Mix（日本志贺县高原市）在总体积为25μl的条件下进行反应：在95°C下初始2 min后，将样品在94°C下进行40次循环，20 s用于变性，30 s用于退火，45 s用于72°C下的伸长率。最后，将样品在72°C下放置10分钟，以结束此反应。使用已知对照DNA的连续稀释液生成标准曲线。所有样品均扩增为三份。使用标准曲线法进行绝对定量，并表示为对照组的“倍数增加”。

蛋白质印迹分析

对肝脏样本进行处理，并按照报告进行western blot分析（Tong等人。，2017). 主要抗体，包括抗复合物I（0.5μg/ml Santa Cruz Biotechnology，Inc.，USA）、抗复合物II（0.4μg/ml，Santa Crux Biotechnology，Inc，USA使用抗体。

复合物IV的酶活性

使用生物化学试剂盒（美国密苏里州圣路易斯Sigma）检测复合物IV活性。简单地说，使用线粒体分离试剂盒从新鲜肝组织中分离出8周龄子代大鼠的线粒体部分（皮尔斯，罗克福德，伊利诺伊州，美国）。COX活性通过测量550 nm处还原细胞色素C在60 s内的氧化来检测（nmol氧化细胞色素C每分钟每毫克蛋白质）。酶活性计算如下：单位/ml=（ΔA/min×dil×1.1）/（（酶体积）×21.84）。

统计分析

结果表示为平均值±标准误差（SEM）。数据通过Bonferroni的单向方差分析（ANOVA）进行分析事后的，事后的测试（Graph Pad Prism 5.01版，Graph Pad-Software，加利福尼亚州拉霍亚）。的价值P（P）小于0.05被认为具有统计学意义。

结果

子代大鼠体重的变化

与对照组的幼崽相比，产前LPS暴露组的出生体重显著降低（6.74±0.04g vs.7.43±0.05g，n个= 10,P（P）<0.01）和1周龄(P（P）< 0.01). 然而，怀孕期间接触LPS的母鼠幼崽自2周龄起体重持续增加(P（P）<0.05或0.01）（图​（图1A）。1安培). 哺乳后，对照组和脂多糖组的幼崽均被分成两组，分别在5至8周龄期间接受标准或高脂肪饮食。尽管四组子代大鼠的每日食物摄入量在质量上没有显著差异，但与对照组或产前LPS暴露子代大鼠相比，HFD和产前LPS+高脂肪喂养组在7周和8周龄时均摄入了显著增加的热量(P（P）<0.05或0.01），因为高脂肪饮食比对照饮食热量更高（图1C、D). 如图所示​图1B，1B年LPS、HFD和产前LPS暴露加高脂肪喂养组的子代体重均显著增加(P（P）<0.01），与5至8周龄的对照组相比。与暴露于脂多糖的母鼠后代相比，高脂肪饮食单独导致5周龄后代体重增加较少（HFD vs.LPS，P（P）<0.05），而联合治疗使8周龄后代的体重显著增加（L+H vs.LPS，P（P）< 0.05). 此外，接受母亲LPS暴露和高脂肪喂养治疗的后代在5岁时体重显著增加（L+H vs.HFD，P（P）<0.05）和6（L+H vs.HFD，P（P）和只接受产后高脂肪饮食治疗的后代相比，年龄小于0.01）周。

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1天、1周、2周、3周和4周龄仔鼠的体重（A）.5至8周大鼠仔鼠的体重（B）.食物摄入（C）和热量摄入（D）5～8周龄的子代大鼠。数据表示为平均值±SEM。n个每组=10。*P（P）<0.05时，**P（P）与对照组相比<0.01，§P（P）< 0.05,§§P（P）与LPS组相比<0.01，#P（P）< 0.05,##P（P）与HFD组相比<0.01（单向方差分析）。Con组，4~8周龄雄性仔鼠，给予产前生理盐水和产后正常饮食；LPS组，4~8周龄雄性仔鼠，产前给予LPS治疗，产后给予正常饮食；HFD组，4~8周龄雄性子代大鼠给予产前生理盐水和产后高脂饮食治疗；L+H组，4~8周龄雄性仔鼠，产前给予脂多糖，产后给予高脂饮食。

子代大鼠的血脂紊乱

显然，任何治疗，包括产前LPS暴露、产后高脂肪喂养和联合治疗，都会导致血清TC水平升高(P（P）<0.01），TG(P（P）<0.01）和低密度脂蛋白胆固醇(P（P）与对照组相比，8周龄的后代分别为<0.01）。除了TG水平显著增加（HFD与LPS，P（P）<0.01），在暴露于脂多糖的母鼠后代中，产前和产后高脂饮食喂养的后代之间TC和LDL-C水平没有显著差异。另一方面，与单独接触LPS的母鼠后代相比，产前接触LPS和产后高脂肪饮食的后代TG显著升高（L+H vs.LPS，P（P）<0.01）和LDL-C（L+H vs.LPS，P（P）<0.01）水平。然而，接受联合治疗的后代表现出最严重的高脂血症状况，表现为TC水平显著升高（L+H vs.HFD，P（P）<0.05）和LDL-C（L+H对HFD，P（P）<0.01）。同时，不同治疗组后代的血清HDL-C水平没有显著差异（图2A–D型).

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血清总胆固醇水平（A）、甘油三酯（B），低密度脂蛋白胆固醇（C）、高密度脂蛋白胆固醇（D），丙氨酸氨基转移酶（E），天冬氨酸氨基转移酶（F）8周龄仔鼠。数据表示为平均值±SEM。n个每组6人。*P（P）< 0.05,**P（P）与对照组相比<0.01，§P（P）< 0.05,§§P（P）与LPS组相比<0.01，#P（P）< 0.05,##P（P）与HFD组相比<0.01（单向方差分析）。Con组，4~8周龄雄性仔鼠，给予产前生理盐水和产后正常饮食；LPS组，4~8周龄雄性仔鼠，产前给予LPS治疗，产后给予正常饮食；HFD组，4~8周龄雄性子代大鼠给予产前生理盐水和产后高脂饮食治疗；L+P组，4~8周龄雄性仔鼠，产前给予LPS，产后给予高脂饮食。

子代大鼠的AST和ALT水平

为了评估肝功能，检测了8周龄后代的血清ALT和AST活性。结果表明，单次产前LPS暴露可显著提高血清AST水平（LPS vs.Con，P（P）< 0.05). 单用高脂肪饮食或产前LPS暴露和高脂肪饮食喂养的协同治疗的子代ALT和AST水平均显著升高（HFD vs.Con，P（P）< 0.01; L+H与Con，P（P）与产前LPS暴露组的后代相比，ALT水平显著升高（HFD vs.LPS，P（P）<0.01）。此外，与出生前接触过LPS的后代相比，出生前接触LPS并伴随4周的高脂肪饮食治疗导致血清ALT和AST水平显著升高（L+H vs.LPS，P（P）< 0.01). 相比之下，与单纯高脂饮食治疗的后代相比，接触LPS的母体后代加上高脂饮食喂养的血清AST水平明显升高（L+H vs.HFD，P（P）<0.01）（图2E、F).

子代大鼠肝脏脂质分布

肝脏脂质谱评估表明，产前LPS暴露、产后HFD喂养和联合治疗均显著增加了肝脏TG(P（P）<0.01），TC(P（P）<0.01或0.05）和LDL-C(P（P）与对照组相比，8周龄的子代中存在<0.01）。与LPS暴露母鼠的子代大鼠相比，单用HFD或产前LPS暴露伴HFD 4周的子代鼠的TG含量均较高(P（P）<0.05或0.01），TC(P（P）<0.05或0.01）和LDL-C(P（P）<0.05或0.01）。此外，产前LPS暴露和产后HFD喂养协同作用显示，肝脏TG含量显著增加(P（P）<0.05）和低密度脂蛋白胆固醇(P（P）<0.05）。然而，四组患者的肝脏HDL-C含量没有明显差异（图​（图3三).

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肝脏甘油三酯含量（A），总胆固醇（B）、高密度脂蛋白胆固醇（C），低/极低密度脂蛋白胆固醇（D）8周龄仔鼠。数据表示为平均值±SEM。n个每组6人。*P（P）< 0.05,**P（P）与对照组相比<0.01，§P（P）< 0.05,§§P（P）与LPS组相比<0.01，#P（P）与HFD组相比<0.05（单向方差分析）。Con组，4~8周龄雄性仔鼠，给予产前生理盐水和产后正常饮食；LPS组，4~8周龄雄性仔鼠，产前给予LPS治疗，产后给予正常饮食；HFD组，4~8周龄雄性子代大鼠给予产前生理盐水和产后高脂饮食治疗；L+P组，4~8周龄雄性仔鼠，产前给予LPS，产后给予高脂饮食。

后代大鼠肝脏形态学损伤

对8周龄仔鼠的肝脏形态学观察显示，对照组仔鼠的肝结构正常，没有脂质积聚。同时，在产前LPS暴露组中，肝脏中观察到少量脂滴和明显的混合淋巴细胞-单核细胞-小静脉周围浸润。单纯的高脂肪饮食治疗会导致大量肝细胞膨胀以及肝脏中大量脂肪堆积。相比之下，暴露于产前LPS和产后高脂肪饮食喂养的后代在肝脏内产生广泛的脂质空泡沉积，并伴有明显的淋巴细胞浸润（图​（图4）。4). 半定量分析表明，不仅LPS暴露母鼠的后代大鼠，而且出生后仅用HFD治疗的后代大白鼠得分为2分，表明组织病理学Kleiner评分为轻度NAFL。此外，产后HFD后的产前LPS暴露得分为4，这与中度NAFL的诊断相符（表​（表1）。1). 这些发现表明，断奶后HDF暴露可能导致肝脏脂肪变性，当后代在发育早期也暴露于LPS时，这种影响明显被夸大。

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8周龄仔鼠肝脏的组织病理学观察。H&E染色左行，油红染色右行。箭头表示肝脏中淋巴单核细胞的静脉周浸润。Con组，4~8周龄雄性仔鼠，给予产前生理盐水和产后正常饮食；LPS组，4~8周龄雄性仔鼠，产前给予LPS治疗，产后给予正常饮食；HFD组，4~8周龄雄性子代大鼠给予产前生理盐水和产后高脂饮食治疗；L+P组，4~8周龄雄性仔鼠，产前给予LPS，产后给予高脂饮食。

表1

根据Kleiner评分系统量化肝脏组织学变化。

脂肪变性气球运动小叶炎症活动得分指示
反对的论点0000正常
液化石油气0011NAFL公司
高频驱动1102NAFL公司
长+高2125美国国立卫生研究院

对于每组，给出每个特征的平均分数（n=3）.

子代大鼠肝脏脂质代谢及其他相关途径的基因表达异常

利用脂蛋白转运和胆固醇代谢相关基因的靶向qPCR阵列检测产前LPS暴露对肝脏脂质代谢的影响。表​表11显示了结果的摘要，这些结果被修改为大于或等于1.3倍的变化，具有统计学意义(P（P）< 0.05). 我们发现4个基因上调，包括细胞色素P450、46家族、a亚家族、多肽1（CYP46A1）、过氧化物酶体增殖物激活受体δ（PPAR-δ）、蛋白激酶、AMP-激活的α2催化亚基（PRKAA2）和极低密度脂蛋白受体（VLDLR），而细胞色素P4507家族、b亚家族、，多肽1（CYP7B1）、24-脱氢胆固醇还原酶（DHCR24）、跨膜7超家族成员2（TM7SF2）和氧化型低密度脂蛋白（类凝集素）受体1（OLR1）在LPS处理母鼠的后代大鼠中表达下调。此外，差异表达基因被分为与低密度脂蛋白受体（OLR1和VLDLR）、胆固醇分解代谢（CYP46A1）、胆固醇生物合成（DHCR24、PRKAA2、TM7SF2）和其他胆固醇代谢途径（CYP7B1、PPARD、VLDLR等）相对应的类别。然而，与胆固醇吸收和转运相关的基因的表达，如ATP-结合盒、亚家族A成员1（ABCA1）、ATP-连接盒、亚家庭G成员1（abcg1）和低密度脂蛋白受体（LDLR），在这两组之间没有显著差异。值得注意的是，在LPS暴露的母鼠后代中，TM7SF2和VLDLR的基因表达显著改变，分别显示下调2.31倍和上调2.75倍（表​（表2，2，图​图5A5A级).

表2

对照组和产前暴露子代大鼠肝脏脂质代谢及其他相关途径中的差异表达基因(n个= 3).

符号全名折叠P（P）-价值
塞浦路斯46a1细胞色素P450，家族46，亚家族a，多肽11.57500.025
Cyp7b1细胞细胞色素P450，家族7，亚家族b，多肽1−1.96070.005
24-脱氢胆固醇还原酶24-脱氢胆固醇还原酶−1.59620.0029
奥尔1氧化低密度脂蛋白（凝集素样）受体1−1.99720.047
帕德过氧化物酶体增殖物激活受体δ1.35540.033
普卡a2蛋白激酶，AMP活化，α2催化亚单位1.43930.01
Tm7sf2型跨膜7超家族成员2−2.31020.015
Vldlr公司极低密度脂蛋白受体2.75490.038
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8周龄仔鼠肝脏基因表达与脂质代谢和其他相关途径相关。（A）对照组和LPS组之间差异表达的基因。RT-PCR阵列检测差异表达基因。2倍的差异和第页值=0.05分别标记为垂直线和水平线。n个=每组3人。Tm7sf2的mRNA表达（B）和VLDLR（C）在仔鼠的肝脏中。数据以平均值±SEM表示。n个每组6人。**P（P）与对照组相比<0.01，§P（P）< 0.05,§§P（P）与LPS组相比<0.01，#P（P）与HFD组相比<0.05（单向方差分析）。跨膜7超家族成员2 Tm7sf2；VLDLR，极低密度脂蛋白受体。Con组，4~8周龄雄性仔鼠，给予产前生理盐水和产后正常饮食；LPS组，4~8周龄雄性仔鼠，产前给予LPS治疗，产后给予正常饮食；HFD组，4~8周龄雄性子代大鼠给予产前生理盐水和产后高脂饮食治疗；L+H组，4~8周龄雄性仔鼠，产前给予脂多糖，产后给予高脂饮食。

随后，我们使用定量RT-PCR测定了不同处理后代大鼠中VLDLR和TM7SF2的mRNA表达。与对照后代相比，在接受单一产前LPS暴露的后代中，Vldlr的mRNA表达水平显著高于对照后代（LPS vs.Con，P（P）<0.01），产后高脂肪饮食（HFD vs.Con，P（P）<0.01）或L+H联合治疗（L+H vs.Con，P（P）< 0.01). 此外，与暴露于LPS的母鼠相比，喂食HFD的子代Vldlr mRNA表达增加更为明显（HFD vs.LPS，P（P）< 0.05). 与仅暴露于产前LPS的后代相比，出生前LPS暴露和出生后HFD喂养协同显著增加了后代中VLDLR的mRNA表达（L+H vs.LPS，P（P）<0.01）或产后HFD（L+H vs.HFD，P（P）< 0.05). 然而，在产前暴露于LPS的后代中，Tm7sf2的mRNA表达显著较低（LPS与Con，P（P）<0.01）和在联合治疗后代中（L+H vs.Con，P（P）<0.01）。与产前LPS暴露后代相比，联合治疗组TM7SF2 mRNA表达明显增加（L+H vs.LPS，P（P）<0.01）（图5B、C).

子代大鼠线粒体膜电位

暴露于LPS的母体后代的肝线粒体产生膜电位的能力显著降低（LPS vs.con，P（P）<0.05），喂养高脂肪饮食的后代（HFD vs.Con，P（P）<0.05），以及联合治疗后代（L+H vs.con，P（P）此外，单独暴露于产前LPS或出生后高脂肪饮食对后代肝线粒体膜电位的影响没有明显差异。然而，与出生前暴露于LPS的后代相比，出生后摄入高脂肪饮食的LPS暴露母鼠后代的线粒体膜电位明显降低（L+H vs.LPS，P（P）<0.01）或仅喂食高脂肪饮食的对照后代（L+H vs.HFD，P（P）<0.05）（图​（图6A6A级).

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肝线粒体膜电位，（A），ATP含量（B）线粒体DNA（MtDNA）损伤（C）8周龄仔鼠。线粒体膜电位和ATP含量的结果表示为%对照，然而，MtDNA损伤表现为线粒体共同缺失对照的“倍增加”。数据表示为平均值±SEM。n个每组6人。*P（P）< 0.05,**P（P）与对照组相比<0.01，§P（P）< 0.05,§§P（P）与LPS组相比<0.01，#P（P）< 0.05,##P（P）与HFD组相比<0.01（单向方差分析）。Con组，4~8周龄雄性仔鼠，给予产前生理盐水和产后正常饮食；LPS组，4~8周龄雄性仔鼠，产前给予LPS治疗，产后给予正常饮食；HFD组，4~8周龄雄性子代大鼠给予产前生理盐水和产后高脂饮食治疗；L+H组，4~8周龄雄性仔鼠，产前给予脂多糖，产后给予高脂饮食。

子代大鼠ATP含量

产前LPS暴露、母体LPS暴露和产后高脂喂养仔鼠的肝脏ATP水平分别比对照仔鼠低29.84%和31.68%。相反，与对照子代和产前LPS暴露子代相比，仅接受产后HFD治疗的子代的肝脏ATP水平显著升高（HFD vs.LPS，P（P）< 0.01). 与单次接触高脂肪饮食或产前LPS的后代相比，联合治疗显著降低（L+H vs.HFD，P（P）< 0.05; L+H相对于LPS，P（P）<0.05）子代大鼠肝脏ATP水平（图​（图6B6亿).

子代大鼠线粒体“常见”缺失

通过鉴定线粒体“常见”缺失来检测线粒体DNA损伤。完整的16-kb线粒体基因组编码37个基因和4977-bp MtDNA常见缺失，从核苷酸位置8470到13447 bp，跨越5个tRNA基因和7个编码线粒体呼吸链多肽的基因：ATP合酶亚基6（复合物V）、细胞色素c氧化酶（复合物IV）、，4种NADH辅酶Q还原酶多肽（复合物I）（ND3、ND4、ND4L和ND5）和5种小tRNA（Andrews等人。，1999; Dani等人。，2004). 与对照后代相比，产前LPS暴露后代的肝脏常见缺失率增加了2.66倍、1.9倍和5.32倍（LPS vs.Con，P（P）<0.01），高脂肪饮食喂养的后代（HDF vs.Con，P（P）<0.01）和接受联合治疗的后代（L+H vs.Con，P（P）<0.01）。此外，与产前接触LPS的后代相比，仅在后代中接触HFD的后代产生的共同缺失率更低（HFD vs.LPS，P（P）< 0.05). 同时，与接受单一产前LPS暴露的后代相比，联合治疗显著增加了常见缺失率（L+H vs.LPS，P（P）<0.01）或产后高脂肪饮食（L+H vs.HFD，P（P）<0.01）（图​（图6C6摄氏度).

子代大鼠肝脏复合物I、II、III、IV和V的表达

为了进一步评估线粒体呼吸复合体的表达或活性变化是否与线粒体DNA损伤相关，我们检测了肝脏中呼吸复合体亚基的蛋白表达和活性。与对照后代相比，母亲LPS暴露导致复合物IV的表达明显降低（LPS vs.Con，P（P）尽管与对照组或LPS组的后代相比，仅用HFD处理的后代中复合物II、III和IV的表达没有显著差异，但复合物IV的表达与对照后代相比显著增加（HFD vs.Con，P（P）<0.05）和LPS暴露母鼠的后代（HFD vs.LPS，P（P）<0.01）。此外，与对照组相比，联合治疗导致复合物IV的表达显著降低（L+H vs.Con，P（P）<0.01）和单个高脂肪喂养的后代（L+H对HFD，P（P）<0.05）（图7A-E型).

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8周龄仔鼠线粒体呼吸复合物蛋白的变化。线粒体呼吸复合物I的蛋白表达（A），二（B），III类（C），四（D）、和V（E）线粒体呼吸复合物蛋白IV的活性（F）数据表示为平均值±SEM。n个每组6人。*P（P）< 0.05,**P（P）与对照组相比<0.01，§P（P）< 0.05,§§P（P）与LPS组相比<0.01，##P（P）与HFD组相比<0.01（单向方差分析）。Con组，4~8周龄雄性仔鼠，给予产前生理盐水和产后正常饮食；LPS组，4~8周龄雄性仔鼠，产前给予LPS治疗，产后给予正常饮食；HFD组，4~8周龄雄性子代大鼠给予产前生理盐水和产后高脂饮食治疗；L+H组，4~8周龄雄性仔鼠，产前给予脂多糖，产后给予高脂饮食。

子代大鼠的复合物IV活性

产前接触LPS的后代肝脏中复合物IV的酶活性显著降低（LPS vs.Con，P（P）<0.01），出生后高脂肪饮食（HFD vs.Con，P（P）<0.05）和联合治疗（L+H vs.Con，P（P）此外，与LPS暴露母鼠后代的酶活性相比，出生后高脂肪喂养显著提高了复合物IV的酶活性（HFD vs.LPS，P（P）<0.05）（图​（图7F第7页).

讨论

在这项研究中，主要发现是，母亲在怀孕期间接触LPS会导致8周龄雄性后代大鼠的脂质结构紊乱，其特征是TC、TG和LDL-C水平显著升高，即使是在标准喂养条件下也是如此。有研究表明，孕期母亲的脂多糖治疗加速了成人心血管相关疾病的发展，包括高血压、肥胖、动脉粥样硬化、心肌肥厚（Wei等人。，2007,2013; Zhao等人。，2014). 据我们所知，这些最新数据首次提供了直接的实验证据，支持了这样一种观点，即产前接触脂多糖会引起血脂水平的改变，这可能会改变后代以后罹患心血管疾病的风险。许多流行病学研究表明，饮食与饱和脂肪和胆固醇的摄入有关，是血脂异常、动脉粥样硬化和其他心血管和代谢疾病发生的重要危险因素（LaRosa等人。，1990; 美国心脏协会营养委员会等。，2006). 我们的研究结果表明，在4-8周龄的高脂饮食后，产前接触过脂多糖的后代的血脂谱紊乱和体重增加更为显著，强调宫内环境不良所导致的内在脆弱性，在面临成年期饮食脂肪过多等风险因素时，这种脆弱性应变得明显。值得注意的是，我们目前的研究仅限于雄性后代大鼠，因为雌性大鼠由于雌激素对脂质代谢的影响而需要评估发情期（Faulds等人。，2012; Kolovou等人。，2014).

肝脏在脂蛋白、胆固醇和TG的调节中起着关键的生理作用。然而，在我们的研究中，母亲服用LPS会导致肝脏结构和功能的不良变化，并伴随着8周龄仔鼠肝脏TG的积累。人们普遍认为，不良的产前环境可以通过一种称为“程序设计”的过程来改变产后生理，包括胎儿的结构和细胞变化，以确保短期存活，但这也可能导致后期结构和功能受损。孕期服用LPS可在最后一次服用LPS 2 h后提高母体血清和胎盘中的TNF-α和IL-6水平，而注射LPS 48 h后胎儿中仅IL-6 mRNA表达明显增加。与母体血清和胎盘中TNF-α和IL-6快速而强劲的增加相比，胎儿中IL-6的延迟升高揭示了胚胎发育的改变可能间接由母体源性促炎细胞因子的暴露引起，也可能直接由子宫内LPS（Deng等人。，2016). 我们之前已经表明，孕期母亲接触LPS对后代大鼠的心脏、冠状血管、肾脏和脂肪组织产生了深刻的编程效应（Gao等人。，2014; Zhao等人。，2014; Chen等人。，2015; Zhang等人。，2016). 鉴于程序设计涉及应激反应中发生的基因表达模式的适应性变化，我们引入了一种靶向特异性qPCR阵列来检测子代大鼠肝脏脂质代谢和相关通路中的基因表达。在本研究中，产前接触LPS导致VLDLR基因表达发生显著变化，显示上调2.75倍。VLDLR是LDL受体超家族的成员。在外周组织中，VLDLR结合载脂蛋白E甘油三酯丰富的脂蛋白（TRL）并调节其摄取（Takahashi等人。，1995). 或者，LDLR缺乏小鼠肝脏中VLDLR的长期稳定过度表达增加了肝脏TG含量，尽管它改善了血脂谱和主动脉粥样硬化（Oka等人。，2001). 虽然稳定过度表达VLDLR的HepG2细胞表现出细胞内甘油三酯积累增加，但VLDLR缺陷小鼠可抵抗脂肪肝（Wang等人。，2014). 在心肌细胞中，缺氧/缺血诱导的脂质积累依赖于VLDLR的表达（Perman等人。，2011). 尽管TM7SF2基因对胆固醇生物合成的需求具有适应性，但似乎已经很成熟（Bennati等人。，2008)，我们的数据显示，母体LPS给药在子代大鼠中引起显著的下调（2.31倍）。最近的研究表明，hTM7SF2蛋白的过度表达可以逆转炎症表型（Bellezza等人。，2013). 因此，TM7SF2基因缺失呈现局部炎症表型，与产前LPS激发的子代大鼠肝脏中促炎细胞因子（如IL-1β、IL-18和TNF-α）的较高mRNA表达一致（数据未显示）。此外，LPS暴露母鼠后代中的其他基因，包括CYP46A1、PPARD、PRKAA2、CYP7B1、DHCR24和OLR1，它们在脂质代谢过程中负责不同的环节，似乎都有适度的表达水平改变。总的来说，参与脂质代谢的肝脏基因的扰动表明，在产前接受LPS治疗的子代大鼠中，有利于强化脂质生成的代谢转变，并表明高脂饮食易诱发强化血脂异常。此外，TM7SF2基因的缺失也意味着不应排除肝脏炎症对血脂异常的影响。然而，在我们的案例中，明确关系的证据仍需要进一步调查。

线粒体控制着肝脏脂质代谢的中心枢纽，也受到参与肝脏代谢的上游信号通路的影响。线粒体包含由磷脂双层和蛋白质组成的内外膜。电子传递链（ETC）嵌入线粒体内膜，由四个酶系复合物（复合物I–IV）和ATP合成酶组成，它们作为生物机器协同工作。因此，任何复合物的丢失可能至少是ATP生物生成受损的部分原因。4977-bp的“常见”缺失虽然存在低丰度，但在慢性肝病、动脉粥样硬化和阿吉格相关疾病的发病机制中经常观察到，表明线粒体受损（Botto等人。，2001; Pavicic和Richard，2009; Guo等人。，2017). 在这项研究中，我们发现了妊娠期接受LPS刺激的母鼠后代存在肝线粒体功能障碍和线粒体DNA（MtDNA）损伤的证据，如ATP含量减少、膜电位降低、线粒体呼吸复合体蛋白表达和活性下降、，以及4977-bp MtDNA共同缺失水平的增加，表明线粒体“启动”的先例，这种启动持续到成年。关于脂质代谢异常，迄今为止已描述了线粒体功能障碍的不同机制，包括线粒体DNA耗竭、呼吸链复合体活性降低和线粒体β-氧化受损。例如，ETC活性和表达的降低可能会迫使活性氧物种的密集生成，而活性氧物种已被证明会启动脂质过氧化反应并触发炎症细胞因子的释放，从而导致血脂异常（Begriche等人。，2011). 铝应干扰ATP生成和线粒体功能，从而将进入的代谢物转向VLDL生成（Mailloux等人。，2007). 值得注意的是，由于肝脂肪酸代谢酶表达的改变，子宫胎盘功能不全导致子代大鼠肝脏脂质积聚（Lane等人。，2001). 在这种情况下，线粒体功能受损可能是导致肝脏脂质失衡的部分原因，从而改善母体LPS给药的子代大鼠的血脂异常。

在这项研究中，值得注意的是，单独喂食高脂肪饮食的后代的线粒体功能障碍表现出不同的模式，包括显著更高的ATP水平、复合物表达的增加趋势和复合物IV的强制表达。然而，发现复合物IV活性急剧下降，表明肝线粒体经历了一种适应性反应，可能试图保持ATP合成和线粒体平衡。随后，当高脂饮食持续12周时，线粒体弹性丧失，并伴有脂质代谢异常加剧（数据未显示）。这些变化与肥胖人类和患有非酒精性脂肪性肝炎的小鼠线粒体功能增强的报告相一致，后者随后在脂肪性肝炎中被废除（Buchner等人。，2011; Koliaki等人。，2015). 另一方面，接受脂多糖和断奶后高脂肪饮食喂养的母鼠后代表现出进一步恶化的线粒体功能障碍，伴随着更严重的肝脏脂质积聚和血脂谱紊乱，强调先前存在的线粒体疾病有助于增加出生后高脂肪饮食的易感性。

值得一提的是，与我们的数据不一致，Hao等人发现对照组和LPS处理组的后代大鼠的体重和血脂水平没有差异。此外，Hao等人还提到，成年期高脂肪饮食喂养不能在产前HFD和LPS协同暴露的子代大鼠中产生强制形式的体重增加和血脂异常（Hao等人。，2014). 我们已经证明，产前LPS（0.79 mg/kg）会导致局部炎症，包括脂肪组织（Gao等人。，2014)和肝脏（数据未显示），这已被很好地证明对肥胖和脂质代谢障碍的贡献（Dandona等人。，2005; Jung和Choi，2014). 值得注意的是，在Hao的研究中，怀孕大鼠服用了0.40 mg/kg而不是0.79 mg/kg的LPS，我们推测剂量差异可能会导致不同的结果。根据Hao等人的说法，对断奶后高脂肪饮食的钝感可能是产前LPS治疗和高脂肪饮食相互作用的结果。然而，我们仅采用母亲接触LPS的模型来评估后代的易感性。因此，我们的研究无法检测到郝氏模型中出现的预测性适应性反应。总的来说，我们应该注意不同剂量的LPS，甚至是早期不同压力的协同作用对成人疾病的影响。

限制

本研究侧重于孕期母亲接触LPS对雄性后代脂质谱的影响。我们无法确定参与肝脏脂质代谢的基因网络紊乱与线粒体功能受损之间的潜在关系。然而，已有文献证明，胆固醇代谢和炎症之间的联系可以通过TM7SF2基因来证明，胆固醇生物合成缺陷反过来可能会破坏与炎症反应相关的转录因子的微调调节（Gatticchi等人。，2015). 越来越多的证据表明，线粒体位于维持炎症和脂质代谢的会聚点（Blas-García等人。，2016; Thoudam等人。，2016). 因此，TM7SF2基因表达下调导致线粒体功能障碍和脂质谱异常，这需要进行广泛研究。

结论

这项研究强调，在发育早期接触LPS可能会导致雄性后代大鼠的脂质代谢紊乱，其中涉及与脂质代谢和线粒体功能相关的基因的编程表达。特别是，当后代大鼠在成年环境中遇到高脂饮食时，这些发育性重编程表型被夸大，导致严重的血脂异常。总的来说，这一发现可能揭示出血脂异常的一个新的危险因素。因此，早期炎症调节的治疗策略可能为预防成年期心血管疾病和代谢性疾病提供了一种新的方法。

作者贡献

YL和HZ：设计和执行实验，起草和修订手稿，并准备手稿的最终版本；SY、YW和JL：进行了实验；YL：对数据进行分析和解释。所有作者阅读并批准了提交出版的版本。

利益冲突声明

作者声明，该研究是在没有任何可能被解释为潜在利益冲突的商业或金融关系的情况下进行的。

致谢

本研究得到了国家自然科学基金的资助(N个81573440中，N个. 81373420).

补充材料

本文的补充材料可以在以下网站上找到：https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fphys.2018.00542/full#补充-材料

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