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PLoS一号. 2017;12(10):E0186192。
在线发表于10月19日2017。 杜伊:101371/Neal.Po.0186192

程序性细胞死亡配体-1在肺癌中的异质性在肺癌中常见

中村由里,数据整理,形式分析,调查,方法论,项目管理,可视化,写作-原稿,写作-评论和编辑, 肯塔罗夏亚希,调查,方法论,验证,1个, 伊木木香,调查,方法论,验证,写作-原稿, 北村,数据整理,调查, 大岛优子赤泽,写作-评论和编辑, 黑板川,写作-评论和编辑,1个, 鲁本格罗恩,写作-评论和编辑, 铁木信一,资源,写作-评论和编辑, 山崎,资源,写作-评论和编辑, 北野武·纳加亚苏,资源,写作-评论和编辑,福冈君亚,概念化,方法论,项目管理,资源,监督,验证,可视化,写作-原稿,写作-评论和编辑1个,*
Sumitra Deb编辑

关联数据

补充材料
数据可用性声明

摘要

程序性细胞死亡配体-1(PD-L1)的表达可预测肺癌细胞程序性死亡-1和PD-L1抑制剂的应答。然而,PD-L1表达的瘤内异质性的程度,可能导致假阴性结果,在很大程度上是未开发的。我们旨在通过应用组织芯片(即螺旋阵列)的新方法评估手术切除的肺癌标本中PD-L1表达的瘤内异质性,这使得我们能够观察螺旋形组织核的异质性。腺癌和鳞状细胞癌标本是从2009年以来在长崎大学医院(日本长崎)接受手术切除的肺癌患者中获得的。小细胞肺癌和大细胞癌标本从同一档案中的患者中选择,自1998以来接受切除手术。螺旋阵列由螺旋形核构建,由每种情况的代表性块制备,使用抗PD-L1抗体进行免疫组化。每个核被分为8个片段,每个片段分别用1%、5%、10%和50%的阈值分为PD-L1阳性或PD-L1-阴性。共选择标本138例,其中腺癌60例,鳞状细胞癌59例,小细胞肺癌12例,大细胞癌7例。具有PD-L1阳性片段的大多数标本表现出异质性表达(即,在核心内具有PD-L1阳性和PD-L1阴性片段的混合物),而不考虑阈值(1%、66.7%、5%、74.4%、10%、75.8%和50%、85.7%)。观察到PD-L1阳性片段比例的大的变化。至少50%的核内的片段在不均匀的PD-L1表达的病例中不少于50%(范围,50~76%)。总之,在肺癌病例中经常观察到PD-L1表达的瘤内异质性。因此,可能需要多个肿瘤活检标本来精确地确定PD-L1表达状态。

介绍

肺癌是癌症相关死亡率的首要原因。5年相对存活率是世界范围内的10—15%。目前在日本有29.7%人。]. 虽然在过去的几十年中,肺癌患者已经被用各种定制的治疗策略治疗(例如,根据组织类型或基因表达谱)。,存活率仍然很低。最近,针对免疫检查点分子的免疫治疗,特别是程序化细胞死亡-1和程序化细胞死亡配体-1(PD-L1),已被美国食品和药物管理局批准用于治疗晚期非小细胞肺癌(NSCLC),并正在改变治疗肺癌的范式。]. 同时,用免疫组化(IHC)评估PD-L1表达已成为预测这些疗法应答的生物标志物。,]. 然而,以前的研究已经报道了广泛的PD-L1在NSCLC的表达,范围从7.4%到72.7%的病例。,十一]. 此外,已经观察到治疗反应不仅在被分类为IHC的PD-L1阳性的患者中,而且在一些被归类为IHC的PD-L1-阴性的患者中被观察到,表明从PD-L1阳性区域发生了不足的取样的可能性。一些研究已经报道了肺癌中PD-L1表达的瘤内异质性。然而,非均质性的速率和特征仍有待探索。德意志北方银行十五].

在本研究中,我们旨在评估独特的组织芯片技术,螺旋阵列,使我们能够观察到螺旋形组织核的异质性,在外科手术切除的肺癌标本中PD-L1表达的瘤内异质性。十六十八].

材料和方法

道德声明

2016年7月26日,长崎大学(长崎,日本)伦理审查委员会(批准号:16072526)批准了研究协议。在手术时从每个患者获得知情同意。

组织标本

腺癌和鳞状细胞癌标本前瞻性地获得了连续的肺癌患者谁经历了手术切除在长崎大学医院(长崎,日本)自2009。小细胞肺癌和大细胞癌标本也从我们机构存档的患者中选出,但是自从1998以来手术切除的患者,因为这些组织类型的频率不高而导致病例数量较少。病理报告进行了审查,只有一个这些组织学成分的患者包括在内。还回顾了苏木精和曙红(H&E)染色的幻灯片,排除了数量不足的恶性细胞构建螺旋阵列。缺乏足够的福尔马林固定,石蜡包埋组织的患者也被排除在外。

螺旋阵列结构

如上所述构造螺旋阵列(图1) [十七]. 简言之,从每个病例中选择具有最具代表性的肿瘤组织学和足够数量的单个组织块。用扫描电镜对相应的H-E染色玻片进行数字化扫描。®APCIO CS2幻灯片扫描仪(徕卡微系统,墨尔本,澳大利亚)。检查每个H&E染色的幻灯片扫描的整个幻灯片图像,以选择和标记两个连续的感兴趣区域(X和Y轴)在构建螺旋阵列之前。随后,将两个120μm厚的剖面从每个块切割并排列在螺旋阵列构造器上(樱花Fielek日本株式会社,东京,日本),因为每个截面上的X轴或Y轴在同一方向上排列。对齐的部分被卷成圆柱形并沿着反射X和Y轴的线切割。分离的卷筒中的一个垂直嵌入到接收块中以构建螺旋阵列。最后,用螺旋阵列块制备4μm厚的切片,用H&E染色和IHC进行组织病理学评价。

一个包含图片、插图等的外部文件。对象名称是Po.0186192.G01.jPG。
螺旋阵列结构。

从每个病例中选择一个代表性的块,并通过回顾苏木精和曙红染色的幻灯片来选择并标记两个连续的感兴趣区域(X和Y轴)。两个120μm厚的切片从每个块切片,并与X和Y轴对齐。这两个部分被卷成一个圆柱形并沿着反射X和Y轴的线切割。螺旋阵列核心垂直嵌入受体块。从螺旋阵列块中制备四μm厚的切片,进行进一步的组织病理学评价。

抗体选择与免疫组化

筛选出具有良好特征的抗PD-L1(克隆28 - 8;ABCAM,剑桥,MA,美国)和抗分化簇68(CD68)(克隆KP1;DAKO,格洛斯楚普,丹麦)抗体。使用自动染色系统(徕卡Brand III;徕卡微系统)进行IHC。抗体稀释液被优化为1:100,用于抗PD-L1和1:400的抗CD68。使用蒸馏水对玻片进行脱蜡和再水合,随后进行PD-L1(热诱导抗原在pH 9的检索)或CD68(蛋白水解处理)的处理。与原代抗体(抗PD-L1,30分钟;抗CD68,15分钟)孵育后,将组织切片冲洗,PD-L1染色切片进一步与EnVIEW Flex +兔连接器(DAKO)和EnVIEV+HRP标记的聚合物(DAKO)一起孵育。CD68染色切片与结合聚合物精制检测试剂盒(徕卡微系统)孵育。用二氨基联苯胺染色,用苏木精进行反染色。制备福尔马林固定的石蜡包埋的人胎盘和扁桃体组织块作为阳性对照。用扫描仪扫描染色玻片作为整个幻灯片图像。®APCIO CS2幻灯片扫描仪(徕卡微系统)。

螺旋阵列PD-L1免疫组化评分

PD-L1的表达仅在肿瘤细胞中进行评价。我们试图排除瘤内免疫细胞,如巨噬细胞和淋巴细胞。PD-L1阳性被定义为在任何强度上在细胞膜上表达PD-L1的任何肿瘤细胞。肿瘤细胞的PD-L1阳性分为四个不同的阳性阈值(1%,5%,10%,50%),其中包括至少100个肿瘤细胞。

为了评估组织异质性,每个螺旋阵列核心分为8个部分,如图所示。图2,阳性或阴性PD-L1表达评分每段。两个或三个独立观察员进行评分。随后在独立观察员和肺专家之间的会议上评价具有观察者间分歧的段,并在达成共识后选择最终分类。螺旋阵列核心内的阳性和阴性区段均被定义为具有异质性PD-L1表达,而对于所有8个区段(阳性/阴性)具有相同结果的病例被定义为具有均一的PD-L1表达。

一个包含图片、插图等的外部文件。对象名称是Po.0186192.G02.jPG。
螺旋阵列核心的8个部分的示意图。

每个核被分为8个片段,用于PD-L1表达的评分。

螺旋阵列与全组织切片的比较

随机选择PD-L1染色阳性者六例。比较了螺旋阵列芯与整个组织切片的染色异质性。

统计分析

患者在诊断时的特征表现为分类数据的频率和百分比,以及连续数据的中位数和四分位数范围。使用Kappa统计量对三名观察员中的所有可能的配对进行PD-L1 IHC评分的观察者间协议。还计算了每个值的平均kappa统计量。十九,二十].

使用微软Excel 2010(微软公司,Redmond,瓦城,美国)和JMP软件对患者特征进行描述和比较分析(版本11;SAS研究所,卡里,NC,美国)。Kappa统计量使用微软Excel 2010(微软公司)和易R软件(埼玉医学中心,埼玉医科大学,日本)计算。二十一一个图形用户界面的R(R基金会统计计算,维也纳,奥地利)。

结果

患者特征

显示患者的临床病理特征。表1. 138例肺癌中,腺癌60例,鳞状细胞癌59例,小细胞肺癌12例,大细胞癌7例。大多数患者为男性(73.9%)。VS. 26.1%),中位年龄70岁(41~90岁)。大多数患者是当前或以前的吸烟者(分别为18.1%和57.3%)。吸烟指数中位数为900(范围为0~3220)。几乎所有患者都有I期、II期或IIIa期疾病(分别为59.4%、22.5%和13.8%)。

表1

患者特征。
特点患者(n=138)
性别,n(%)
男性102(73.9)
女性36(26.1)
年龄(年),中位数(范围)70(41—90)
吸烟状况,N(%)
不吸烟者33(23.9)
戒烟者79(57.3)
吸烟者25(18.1)
未知1(0.7)
吸烟指数,中位数(范围)900(0—3220)
组织学,N(%)
腺癌60(43.5)
鳞状细胞癌59(42.7)
小细胞肺癌12(8.7)
大细胞癌7(5.1)
阶段,n(%)
i82(59.4)
第二31(22.5)
ⅡIIIa19(13.8)
IIIB2(1.4)
4(2.9)
肿瘤大小(mm),中位数(范围)25(9—100)
肿瘤状态,n(%)
T161(44.2)
T260(43.5)
T313(9.4)
T44(2.9)
节点状态,n(%)
n0101(73.2)
N119(13.8)
N216(11.6)
n32(1.4)

PD-L1表达与异质性

每个标准的PD-L1表达的代表性图像示于图3A- 3E. 具有和不具有异种PD-L1表达的代表性核显示在图4A和4B. 呈阴性、异质性和均一的PD-L1表达的病例分布在图5A和5B. 超过1的PD-L1阳性节段的阈值特异性数分别为42(30.4%)、39(28.3%)、33(23.9%)和21(15.2%),分别为1%、5%、10%和10%阈值。大多数病例具有不同的PD-L1表达,而与阈值无关(1%∶66.7%(n=28),5%∶74.4%(n=29),10%∶75.8%(n=25),50%∶85.7%(n=18))。图5A). 当根据组织学类型进行分类时,PD-L1阳性片段在6.7~13.3%的腺癌、25.4~49.2%的鳞状细胞癌、小于25%的小细胞肺癌和28.6%的大细胞癌中有所不同,这取决于所使用的阈值(图5B). 尽管在PD-L1阳性表达的情况下,PD-L1阳性片段的比例在很大程度上不同于阈值(范围,50~76%),但在大多数PDC L1表达中,至少有50%个在PDC L1表达中是阴性的。图6). 在所有6例随机选择的病例中,螺旋阵列和整个组织切片的PD-L1表达的异质性和均一的染色模式是相同的(图7A- 7DS1无花果). PD-L1在螺旋阵列上的异质表达模式与原始的整个组织切片相比较。图7A- 7D

一个包含图片、插图等的外部文件。对象名称是Po.0186192.G03.jPG。
PD-L1表达的代表性图像。

(<<1%,)1—4.9%,C)5—9.9%,)10—49.9%,和(E类(50%)PD-L1阳性细胞(放大倍数200×)。

一个包含图片、插图等的外部文件。对象名称是Po.0186192.G04.jPG。
PD-L1异质性和均匀表达的代表性图像。

()异质性和(PD-L1的均匀表达(放大倍数为150×)。

一个包含图片、插图等的外部文件。对象名称是Po.0186192.G05.jPG。
PD-L1表达阴性、异质、均一的病例分布

()所有138例病例的分布和(根据组织学类型分布。

一个包含图片、插图等的外部文件。对象名称是Po.0186192.G06JPG。
PD-L1表达异质性和PD-L1阳性片段数目不同的病例分布。

黑线的左侧表示负段占核内段总数的50%以上的情况的比例,而黑线的右侧表示正段占核内段总数的50%以上的情况的比例。在任何一个阈值中,核内区段总数的50%以上在不均匀的PD-L1表达的病例中不少于50%(范围,50~76%)。

一个包含图片、插图等的外部文件。对象名称是Po.0186192.G07.JPG。
PD-L1表达在异质性PD-L1表达中的代表性图像

()整个截面(放大倍数,3×),)相应的螺旋阵列核心(放大倍数,15×),C)从虚线划定的区域放大图像。(左)(右)(放大倍数,200×),和()由实线划定的区域放大图像。(左)(右)(放大倍数,200×)。其他5个病例的图像显示在S1无花果.

PD-L1表达分数的观察者间一致性

三个观察员之间的PD-L1 IHC评分的观察者间协议显示在表2. 总共有三个观察员对917个片段进行评分。三个观察员之间的协议段数(即阳性)VS. 每个阈值(1%、5%、10%和50%)分别为814, 824, 850和869。平均Kappa统计量分别为1%、5%、10%和50%阈值分别为0.76、0.75、0.78和0.79。

表2

PD-L1节段免疫组化评分Kappa统计量(n=917)。
门槛
1%5%10%50%
观察者1观察者2零点七二零点七零零点七六零点八零
观察者2观察者3零点七七零点七二零点七五零点七三
观察者1观察者3零点七九零点八二零点八三零点八四
平均零点七六零点七五零点七八零点七九

讨论

在本研究中,使用新开发的组织微阵列方法,即螺旋阵列,我们揭示了肿瘤内PD-L1表达的异质性在肺癌中是常见的。在过去的研究中,PD-L1表达的瘤内异质性已在实体肿瘤中报道,包括肺癌、乳腺癌、黑色素瘤和肾细胞癌。,德意志北方银行十四,二十二二十九]. 然而,大多数研究已经评估了原发灶和转移灶的瘤内异质性。十四,二十六并且只有少数的研究已经评估肿瘤内肿瘤的异质性。麦克劳林. [德意志北方银行例如,最近用IHC和定量荧光评价了手术切除的NSCLC肿瘤内瘤内异质性,并报告了PD-L1表达的瘤内异质性的存在。此外,尸检病例报告显示,PD-L1和相关的免疫遗传谱根据同一患者的转移部位不同。十五].

据我们所知,这是第一次研究使用多个阈值的节段性方法评估肺癌瘤内异质性。我们使用螺旋阵列技术与8个分割的核心,以评估瘤内异质性。具有PD-L1阳性和PD-L1阴性片段的核内的标本被定义为具有异质性PD-L1表达。我们的研究结果表明PD-L1在其表达中经常表现出异质性。图5A). 有趣的是,核内8个片段的50%以上的PD-L1表达阴性,不少于50%的PD-L1表达异质性(范围为50~76%)。因此,在使用小活检标本的评估中,具有异质PD-L1表达的病例更可能返回假阴性结果。最近,伊利耶. [十四和Kitazono. [二十六比较PD-L1在非小细胞肺癌手术切除标本和匹配的小活检组织中的表达。不一致率的大差异(48%)VS. 7.6%)在两个报告之间观察到。我们的发现与伊利耶的发现相当。. [十四这提示在诊断活检中的PD-L1状态可能不能反映在许多情况下切除标本中的PD-L1状态。肺癌通常仅在临床分期中被发现,小活检是诊断和分子测试的常用的主要方法。PD-L1的表达也通常在临床上使用小活检标本进行评估。三十,三十一]. 因此,应从单个部位获得更高数量的活检标本。然而,很少有研究评估活检标本的数量与生物标志物敏感性之间的关联。

观察者间关于PD-L1表达分数的一致性根据阈值略有不同。然而,所有的阈值都产生了良好的。三十二]. 三个观察者之间的不一致可能与无意中包含对PD-L1染色阳性的免疫细胞(例如,浸润肿瘤巢的树突状细胞或巨噬细胞)有关。虽然CD68 IHC被用来消除巨噬细胞,但在某些情况下,很难区分肿瘤细胞和巨噬细胞。图8A- 8C). 因此,我们建议至少两个病理学家对每种情况进行PD-L1评分,并且CD68 IHC应该被用于评估PD-L1在临床中的表达。

一个包含图片、插图等的外部文件。对象名称是Po.0186192.G08JPG。
具有类似肿瘤细胞的巨噬细胞的代表性图像。

免疫组化分析)PD-L1和()CD68表达,和(C苏木精-伊红染色(放大倍数200×)。

这项研究有几个局限性。首先,我们回顾性评估手术切除标本,PD-L1的表达通常在临床上使用小活检标本进行评估。第二,我们仅使用一种抗体(克隆28~8)对PD-L1进行限制,以限制由不同克隆之间的抗原识别差异引起的混淆。克隆28 - 8已被几个研究者所表征,并用于肺癌的临床试验中。二十八,三十三三十七]. 最后,仅使用螺旋阵列技术获得数据,因为在以前的研究中已经建立了螺旋阵列和整个组织切片的发现之间的一致性。十七].

结论

在肺癌病例中经常观察到PD-L1表达的瘤内异质性。因此,我们的研究结果表明,需要大量的肿瘤活检标本来准确地确定PD-L1表达状态。

支持信息

S1无花果

随机选择六例螺旋阵列和整个组织切片的异质染色。

6例均观察到相同的染色模式。

(PDF)

筹资声明

JF以病理学研究所的薪酬形式获得支持,出资人在研究设计、数据收集和分析、出版决定、稿件准备等方面没有任何额外的作用。这些作者的特定角色在“作者贡献”部分中得到阐述。

数据可用性

所有相关数据均在论文及其支持信息文件中。

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