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《公共科学图书馆·病理学》。2016年10月;12(10):e1005950。
2016年10月20日在线发布。 数字对象标识:10.1371/日志.ppat.1005950
预防性维修识别码:PMC5072739
PMID:27764245

表观遗传化合物库筛选通过BRD4桥接P-TEFb到病毒基因启动子促进HSV-1和-2复制的BET抑制剂

科仁#12 张伟(音译)#12 陈晓青(Xiaoqing Chen)3 马英玉12 粤代2 范一梅1 侯雅仪1 任湘潭124*李二光12*
Robert F.Kalejta,编辑器

关联数据

补充资料
数据可用性声明

摘要

人类HSV-1和-2是人类疾病的常见病原体。宿主和病毒因子均参与HSV裂解感染,但具体机制尚不清楚。通过筛选表观遗传调控的化学文库,我们确定了溴代多巴胺蛋白4(BRD4)在HSV感染中的关键作用。我们发现,用泛BD结构域抑制剂治疗可增强HSV感染。使用JQ1作为探针,我们发现JQ1,一种定义的BD1抑制剂,通过BRD4蛋白发挥作用,因为BRD4表达的下调消除了JQ1对HSV感染的影响。BRD4通过涉及CDK9和RNAP II的复合物形成调节HSV复制;然而,JQ1通过将复合物分配给HSV基因启动子来促进HSV-1感染。因此,抑制BRD4表达或抑制CDK9活性可阻止HSV感染。我们的数据支持一个模型,即JQ1通过将BRD4从染色质靶向转换为病毒基因表达的转录调节来增强HSV感染,因为BRD4 BD1或BD1/2结构域的瞬时表达与JQ1治疗的效果相似。除了确定BRD4是JQ1作用于HSV感染的调节剂外,本研究还证明BRD4在HSV感染中具有重要作用。

作者摘要

人类HSV-1与感冒有关,而HSV-2被认为是性传播感染的病原体。HSV-1和HSV-2的溶血感染在病毒努力表达自己的基因和复制时触发细胞反应。为了研究参与裂解感染周期的宿主因子,我们筛选了一个表观遗传调控的化学库,并鉴定了几种增强HSV-1和HSV-2感染的BET溴代多巴胺抑制剂。使用定义明确的BRD4抑制剂JQ1作为模型,我们表明JQ1通过将BRD4分配给病毒基因启动子来增加HSV感染。我们还发现,BRD4通过招募转录延长因子来调节HSV-1和HSV-2裂解感染。该研究扩展了病毒复制调控的知识,并确定了抗病毒药物的新靶点。

介绍

单纯疱疹病毒-1和-2(HSV-1、HSV-2)是人类疾病的重要病原体[12]. HSV-1感染主要与唇疱疹和水疱有关,而HSV-2是性传播感染的主要因素[34]. 患者在相对年轻的时候感染HSV-1,而最初的HSV-2感染主要发生在青春期后,通常在亲密接触后传播[5]. 据估计,三分之二的15-49岁成年人感染了HSV-1,而超过5.5亿15-49岁的人生殖器感染了HSV1或HSV-2[12].

HSV-1和HSV-2是基因相似的双链DNA病毒,在感染和复制方面具有许多共同特征。病毒最初通过直接接触获得,并在粘膜上皮细胞内复制。同时,病毒粒子可以进入感觉神经元的神经末梢,并穿过细胞体,建立潜伏期。潜伏感染是病毒的蓄水池,可反复感染并传播给其他人。尽管在我们对HSV感染的理解方面取得了不可估量的进展,但负责HSV复制调控的分子机制仍然难以捉摸,基本上令人困惑。

HSV复制涉及多种病毒和细胞因子[6]. 在上皮细胞感染HSV后,80多个病毒基因以时间级联的方式依次表达,包括即时早期基因、早期基因和晚期基因。同时,HSV基因组迅速并入带有组蛋白修饰的核小体,这些组蛋白修饰类似于异色结构的特征[78]. 组蛋白修饰在HSV裂解和潜在感染中起着重要作用。例如,据报道,抑制组蛋白脱乙酰酶活性的化学物质可增强病毒复制[910]. 组蛋白去甲基化酶LSD1的抑制阻止了潜伏期的病毒裂解复制和再激活[1112]. 表观遗传调控的其他因素是否在单纯疱疹病毒感染中发挥作用还没有得到很好的研究。

我们通过筛选表观遗传调控的化学库来确定影响HSV感染的因素。该库包括HDAC、甲基转移酶、极光激酶等明确定义的抑制剂。除了TSA(一种已知的HDAC抑制剂,据报道可增强HSV-1和HSV-2感染性)外,我们还发现了几种结构不同的BRD4抑制剂,可促进HSV-1与HSV-2的感染。BRD4是溴代谢物和末端外体(BET)家族的成员,包括哺乳动物中的BRD2、BRD3、BRD4和BRDT。BRD4是一个表观遗传读取器,将转录调控复合体招募到乙酰化染色质,因此参与宿主基因调控[13]在HPV转录激活和感染中具有多种功能[14——17]. BRD4与HIV Tat蛋白相互作用,负调控HIV-1复制[18]. 此前没有关于BRD4参与HSV感染的报道。因此,我们进行了详细的研究,发现溴代多巴胺抑制通过促进转录因子与HSV基因启动子的关联来增强HSV感染。

结果

文库筛选确定促进HSV感染的BRD4抑制剂

为了研究表观遗传因子是否调节HSV感染,我们筛选了表观遗传复合文库。我们首先确定了对Vero细胞的毒性作用,Vero细胞是用于初步筛选的宿主细胞系,尽管这些化合物在肿瘤细胞中引起细胞毒性作用的浓度有很好的记录。然后使用最大无毒浓度对Vero细胞进行预处理,以测试对HSV-2感染的影响。在这些研究中,我们还将曲古抑菌素A(TSA)和阿昔洛韦作为对照,因为已知这些化合物可以增强或抑制HSV-2感染。如果一种化合物表现出类似病毒感染的效果,我们随后进行二次感染检测,以定量测量其对病毒感染的影响。我们从一个含有129种化合物的文库中鉴定出了几个候选化合物,这些化合物能够促进与HSV-2感染相关的细胞溶解作用,而该文库中的化合物在感染检测中没有显示抑制作用。除了已知能增强HSV-2感染的HDAC抑制剂(如TSA)外,我们还发现了几种BET溴代烷抑制剂,包括JQ1、I-BET-762、PFI-1和TG101348,对HSV-2的感染具有增强作用。通过使用HSV-1和HSV-2检测到增加的感染性病毒产生,证实了该效果(图1A). 与模拟治疗对照组相比,随着病毒产生量的增加,这些样本中的斑块大小明显增加(图1B). 平均而言,经JQ1处理的样品中的斑块大小增加了250%以上,而经TSA处理的样品的斑块大小大约增加了55-60%。名称、PubChem CID及其对HSV-1和HSV-2感染的影响列于表1.

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BET结构域抑制增强HSV-1和HSV-2的产生。

(A) 通过菌斑试验测定感染性病毒的产生。接种前2小时,用试验化合物或0.1%二甲基亚砜(Mock)处理一式三份的Vero细胞。使用1 pfu/细胞(MOI=1)的HSV-1或HSV-2。这些化合物在感染过程中一直存在。在24小时PI下采集样品,并通过噬菌斑测定法用于滴定感染性病毒。浓度如下:JQ1为300 nM,PFI-1为500 nM,I-BET-762(I-BET)为1μM,TG101348(TG)为3μM,TSA为150 nM。

(B) 斑块大小的代表性化合物JQ1和PFI-1。在存在或不存在HSV-1或HSV-2约50-100 pfu/孔的试验化合物的情况下,感染6孔板中的Vero细胞。用ImageJ对牙菌斑试验的微孔进行拍照,并对随机选择的30个牙菌斑的大小进行测量。绘制斑块的相对大小,并以平均值±标准差表示。使用配对T检验分析数据的统计学意义。*表示p<0.05,**表示p<0.01。

表1

名称、PubChem ID和增加HSV-2感染的最低浓度总结*.

表观遗传学化合物库包含129个小分子化合物,这些小分子化合物被分类为组蛋白去乙酰化酶(HDACi)、赖氨酸去甲基化酶、组蛋白乙酰转移酶(HAT)、DNA甲基转移酶(Dnmts)和表观遗传读取器域抑制剂等。13种化合物对感染有增强作用,而没有化合物表现出抑制作用。为了定量描述它们对HSV-2感染的影响,我们确定了会导致HSV-2感染对照细胞活力变化20%的浓度。在这方面,对化合物进行系列稀释,并在Vero细胞上对三倍样品进行测试。MOI为1用于感染。HSV感染引起细胞溶解作用,通过MTT试验在48–60小时PI测定。

姓名PubChem CID公司欧盟委员会20(毫微米)的抑制剂
曲古菌素A44473230HDAC公司
Quisinostat公司1153845530HDAC公司
CUDC-907公司5457545630HDAC、PI3K
CUDC-101公司24756910100HDAC公司
吉维诺塔9804992100HDAC公司
HDAC-42型6918848100HDAC公司
镇静剂49855250300HDAC公司
Scriptaid公司5186300HDAC公司
图巴斯坦A573365143000HDAC公司
JQ1号4690778750BET溴代多巴胺
PFI-1型71271629100BET溴代多巴胺
I-BET-762型46943432300BET溴代多巴胺
电话101348167228361000BET溴多巴胺,JAK

*导致20%(EC)的浓度20)OD读数的减少被视为增强HSV感染所需的最低浓度。

JQ1增强HSV-1和HSV-2感染的剂量依赖性

文献综述表明,上述BET化合物被开发成抗癌和抗炎药。它们通过占据BD1的乙酰赖氨酸结合囊,选择性地竞争乙酰化赖氨酸残基对抗BET蛋白,特别是BRD4,从而抑制BET蛋白与乙酰化组蛋白的结合,并破坏对宿主基因表达至关重要的染色质复合物的形成[19——22]. 为了阐明溴代多巴胺抑制HSV感染的机制,我们将重点放在JQ1上,因为该化合物的靶点已明确[19]而非活性对映体(-)-JQ1也可在市场上买到。为了初步确定BD结构域抑制是否是HSV感染增强的原因,用JQ1、RVX-208(一种BD2特异性BRD4抑制剂)处理Vero细胞[23]或在感染HSV-1或HSV-2之前出现非活性(-)-JQ1。用300 nM JQ1处理,但不使用RVX-208或(-)-JQ1,导致HSV-1和HSV-2的产量增加(图2A). JQ1对HSV-1和HSV-2感染的影响具有剂量依赖性(图2B),这一结论被病毒蛋白表达增加所证实(图2C). 此外,我们发现这种作用并不局限于Vero细胞,因为用JQ1或PFI-1处理HeLa、HEp-2、SK-N-SH或原代小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)也会增加HSV-1和HSV-2的产生(图AS1文本). 由于Vero和HeLa细胞对JQ1的反应同样良好,我们随后使用HeLa电池进行后续研究。

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溴多巴胺抑制促进HSV-1和HSV-2感染。

(A) BD1和BD2抑制对HSV-1感染的影响。用BD1抑制剂JQ1(300 nM)、BD2抑制剂RVX-208(RVX,500 nM)或HDAC抑制剂TSA(150 nM)处理Vero细胞。(-)JQ1,JQ1的一种非活性对映体,在300 nM时也被纳入对照。治疗后2小时,细胞感染HSV-1或HSV-2(1 MOI)。在24小时PI时采集细胞并用于斑块分析。数据表示为三份样品的平均值±SEM。(B和C)JQ1对HSV感染的剂量效应。按照指示的浓度用JQ1处理Vero细胞。在1个MOI下使用HSV-1或HSV-2。在24小时PI采集样本,通过菌斑试验(B)进行病毒滴定,或通过western blot(C)进行蛋白质表达分析。条形图表示病毒蛋白表达的定量测量(相对于感染但未治疗的对照组)。实验独立进行了3次。数据以两个独立测量值的平均值±SEM表示。(D) 添加JQ1对HSV感染的时间效应。如图所示,在300 nM的时间点用JQ1处理HeLa细胞。接种时间计算为0,-2小时指感染前2小时。在平行实验中,将病毒与300nM JQ1在RT下孵育1小时,然后在稀释后用于感染细胞(Tx-V)。细胞在0.5 MOI下感染HSV-1 36小时,并通过菌斑试验测定病毒产生量。(E) JQ1加速HSV-1感染。在HSV-1感染之前,HeLa细胞被模拟处理或用300 nM JQ1处理(MOI=0.3)。按照指示的时间采集样本,并滴定病毒产生量。

接下来,我们使用HeLa细胞测定了JQ1添加对HSV-1和HSV-2感染的时间效应。我们发现,在接种前2小时(-2小时)或接种后6小时内添加JQ1对HSV感染有类似的影响。当在12小时和24小时PI添加JQ1时,效果变得不那么显著(图2D). 相比之下,接种前用JQ1治疗HSV(Tx-V)对HSV感染的影响很小,表明该化合物没有针对病毒粒子的增强作用。

我们还测量了JQ1存在或不存在时病毒产生的过程(图2E). 在感染过程中,经JQ1处理的样本中的HSV-2滴度高于经车辆处理的对照组。尽管JQ1处理组和未处理组的最高滴度处于可比较的水平,但JQ1治疗组的样品比对照组的滴度高出约12小时。滴度开始下降,可能是由于感染引起的细胞溶解。这些结果表明BD1结构域抑制促进了感染性病毒的产生。

BRD4表达下调限制HSV感染

在溴代主要蛋白中,JQ1被证明以高亲和力靶向BRD4的BD结构域[19]. 尽管有很强的选择性,但我们想验证JQ1通过BRD4促进了HSV感染。在这方面,我们进行了RNAi研究,以确定抑制BRD4表达是否会对HSV感染产生类似的影响。用3种不同的靶向BRD4表达的siRNA或加扰控制(siCtrl)处理HeLa细胞。siRNA处理显著抑制BRD4表达(图3A). 当使用这些细胞检测HSV感染时,我们意外地发现,正如滴定和免疫印迹研究所确定的那样,抑制BRD4表达抑制了病毒的产生(图3A和3B). 自BRD4基因敲除后,该效应是特异性的,但BRD2或BRD3基因敲除对HSV-1和HSV-2感染的抑制作用不明显(图3C、3D和3E). 重要的是,我们发现BRD4表达的下调也消除了JQ1对HSV感染的增强作用(图3F). 众所周知,c-Myc是BRD4和JQ1治疗选择性下调c-Myc表达的下游基因之一[2425]. 事实上,在JQ1处理和BRD4 siRNA处理的样品中,c-Myc表达下调(图BS1文本)siRNA抑制c-Myc并不影响HSV感染。因此,结果清楚地表明,BRD4的表达在HSV感染中起着重要作用,JQ1通过BRD4对HSV-1和HSV-2感染起增强作用。因此,有趣的是描述BD1抑制HSV感染的机制。

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BRD4表达对HSV-1感染和JQ1活性的依赖性。

用对照siRNA(siCtrl)或靶向BRD4的siRNA(si-1,-2,-3)转染HeLa细胞。然后在转染后48小时将细胞用于感染(HSV-1,1 MOI)。通过斑块试验测定病毒生成,而通过免疫印迹法在24小时PI测定病毒蛋白合成。(A) 通过对病毒ICP0和细胞BRD4表达的免疫印迹测定对BRD4表达和对HSV-1感染的siRNA处理。BRD4和ICP0表达式的条形图代表性测量**表示p≤0.01。实验独立进行了3次。(B) BRD4表达对感染性病毒产生的抑制作用。数据以重复样品的平均值±SEM表示。(C,D,E)抑制BRD4,但不抑制BRD2或BRD3,可抑制HSV感染。实时PCR验证了单个siRNA对BRD2、BRD3和BRD4对HeLa细胞中相应基因表达的影响。基因表达标准化为GAPDH,并表示为与siCtrl(C)的相对水平。通过滴定研究(D)和HSV-1蛋白免疫印迹(E)确定,BRD4的抑制,但BRD2或BRD3的抑制不能抑制病毒感染。F.抑制BRD4表达可消除JQ1对HSV-1感染的增强作用。右边的条形图表示BRD4和ICP0蛋白质带的定量测量。JQ1在300 nM下进行测试。

HSV感染的BRD4截短突变体

为了确定BRD4在HSV感染中的作用,我们测试了BRD4的过度表达是否会导致HSV感染的增加。为此,用空载体或表达BRD4的质粒转染易转染的293T细胞。全长BRD4(BRD4 wt)的瞬时表达并没有增加HSV-1的产生,即使该蛋白在高水平表达并正确定位于细胞核(图4A、4B和4C). 由于我们测试的大多数细胞都有高水平的内源性BRD4蛋白表达,我们怀疑内源性BRD水平足以支持HSV感染。

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HSV-1感染中BRD4突变体的过度表达。

(A) BRD4结构示意图。将DNA亚克隆到p3xFLAG-CMV-24载体中,用于哺乳动物细胞表达。(B) 在转染293T细胞的细胞核中检测到BRD4 wt及其突变体。(C) 根据ICP0和ICP4的表达,BRD4 wt的瞬时转染对HSV-1感染没有影响。用p3xFLAG空载体转染6孔板中的293T细胞,或用p3x FLAG-BRD4 wt以0.3和1.0μg转染24小时。然后用0.5 MOI感染HSV-1 24小时。(D)BD1、BD1/2或ΔBD1的瞬时转染增加HSV-1 ICP0和ICP4的表达。293T细胞被转染并用作(C)。(E) 斑块形成试验测定BRD4突变体促进HSV-1和HSV-2感染。

BRD4是一种阅读蛋白,利用其BD结构域与乙酰化赖氨酸残基相互作用。JQ1结合到BD结构域并中断BRD4与乙酰赖氨酸残基的相互作用[19]. 我们推断BD结构域在HSV感染上的功能可能与JQ1类似,因为BD结构区可能与BRD4竞争乙酰赖氨酸相互作用。因此,我们生成了BD1、BD1/2表达载体(图4A). 我们还制备了BD1缺失的BRD4(ΔBD1),以潜在地消除BRD4染色质靶向能力,并测试这些突变体是否支持HSV感染。截短的蛋白质主要在细胞核中检测到(图4B)因为它们保留了假定的核定位信号。免疫印迹和滴定研究表明,与JQ1治疗类似,BD1或BD1/2表达导致HSV感染增加(图4D和4E). 令人印象深刻的是,BD1缺失的BRD4(ΔBD1)对HSV感染的影响与JQ1相似,表明BD1调控的事件与BRD4在HSV感染中的作用相竞争。结果表明,JQ1通过BD1阻断可能转移BRD4的功能来促进HSV感染。

BRD4招募转录调节因子并定位于HSV启动子

除了参与表观遗传学调控外,BRD4还通过招募正转录延伸因子P-TEFb来调节细胞基因的转录[132627]转录激活物和阻遏物[28]. 接下来,我们研究了JQ1是否通过更选择性地将BRD4复合物分配给病毒基因表达来促进HSV感染。我们首先通过CDK9和Rpb-1(P-TEFb和RNAP II的亚单位)的免疫印迹研究了HSV感染是否诱导了涉及BRD4、P-TEFb-和RNAPⅡ的复合物的形成。如所示图5A在未感染的细胞中检测到BRD4、CDK9和Rpb-1之间的弱关联。HSV感染显著诱导BRD4与两种蛋白的结合(图5A)这一观察结果得到了蛋白质共定位免疫染色研究的证实(图5B和5C)表明HSV感染促进了涉及BRD4和CDK9或Rpb-1蛋白的复合物的形成。

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HSV-1感染诱导蛋白质复合物的形成以及与病毒基因启动子的关联。

如图所示,HeLa细胞在10个月内感染HSV-1次。然后对样品进行处理,分别通过免疫沉淀法检测蛋白质关联,通过免疫染色检测蛋白质共定位,通过改良的ChIP法检测蛋白质-DNA相互作用。(A) HSV-1感染促进涉及BRD4、CDK9和RNAP II的蛋白质关联。裂解物中的蛋白质用作输入的对照。条形图表示抗BRD4免疫复合物中蛋白质带强度的定量测量。数据以2个独立测量值的平均值±SEM表示。(B和C)BRD4与CDK9(B)和Rpb-1/RNAP II(C)的共定标。细胞核用DAPI(蓝色)染色。通过PCR(D,F)和实时PCR(E,G)检测BRD4或Rbp-1/RNAP II免疫复合物中的病毒基因启动子。复合物中的GAPDH和IFNβ基因启动子作为对照,用于验证ChIP分析。

然后我们进行了改良的ChIP分析,以确定该复合物是否被招募到病毒基因启动子中。我们使用HSV-1 F株进行这些研究,因为基因组序列很容易获得。PCR证实BRD4与IE病毒基因启动子、早期和晚期基因存在选择性关联(图5D)并用qPCR定量测定(图5E). 它们与BRD4的关联模式与RNAP II相似(图5F和5G). 这种关联是选择性和特异性的,因为在更上游或编码区内退火的引物对未能检测到来自抗BRD4免疫复合物的病毒DNA(图CS1文本).

JQ1增强转录因子与病毒基因启动子的关联

接下来,我们讨论了JQ1是否促进了蛋白质与病毒基因启动子的关联。与HSV-1感染对照组相比,从JQ1处理的样品中检测到抗BRD4免疫复合物中CDK9和Rpb-1蛋白数量增加(图6A),这一观察结果得到了免疫荧光研究的支持(图6B). 同时,在JQ1处理的样品中,BRD4对病毒基因启动子的招募增加,包括ICP0、ICP4、ICP22和gB基因(图6C和6D). 因此,结果表明JQ1促进了HSV基因转录所需的蛋白质复合物的形成。

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JQ1增加BRD4复合物与病毒基因启动子的相互作用。

在没有或存在500 nM JQ1的情况下,在10 MOI的条件下用HSV-1感染HeLa细胞6小时。分别通过免疫沉淀法、免疫染色法和ChIP分析法测定蛋白质关联性及其与病毒基因启动子的相互作用。(A) JQ1促进涉及BRD4、CDK9和Rbp-1/RNAP II的蛋白质复合物的形成。右面板条形图表示免疫沉淀分析中蛋白质带强度的定量测量。(B) JQ1推动BRD4与CDK9共同本地化。标记为a、b和c的放大区域显示在图像下方。DAPI(蓝色)染色显示细胞核。通过qPCR测量(C)和PCR(D),(C,D)BRD4与病毒和宿主基因启动子的关联。(E) JQ1促进病毒DNA合成并诱导BRD4重新分布。在没有或存在500 nM JQ1的情况下,用HSV-1(10 MOI)感染血清饥饿的HeLa细胞4小时。然后用EdU标记细胞4小时。用抗BRD4抗体染色观察BRD4(红色)。绿色:新合成的DNA。

为了进一步证明这一发现,我们通过EdU掺入研究研究了JQ1是否对病毒DNA合成产生影响(图6E). 在血清饥饿的细胞中,EdU掺入仍然很少,而HSV-1感染促进了EdU掺合。在JQ处理的样品中,染色变得更加强烈和深刻。更重要的是,BRD4染色在这些样本中显示出病毒DNA合成与BRD4着色的强共定位,表明JQ1重新定位了BRD4,并且很可能将转录复合体重新定位为病毒基因转录。

BRD4通过CDK9调节RANP II磷酸化调节HSV感染

BRD4在通过RNA和DNA病毒调节病毒感染方面发挥着不同的作用。Brd4在病毒感染过程中主要调节CDK9和RNAP II磷酸化[29——32]. 抑制CDK9已被证明可以阻止DNA病毒感染,包括HSV-1[3334]. 因此,BRD4在HSV感染中的作用是通过使用Rpb-1 CTD磷酸化-Ser2/Ser5的特异性抗体证明CDK9在Rpb-1磷酸化中的作用而最终确定的。HSV感染在3小时PI促进了Rpb-1磷酸化。JQ1治疗导致Rpb-1的磷酸化更强烈,这与这些样本中HSV感染增加有关(图7A). CDK9特异性抑制剂LDC000067治疗可剂量依赖性降低Rpb-1磷酸化和HSV感染(图7B)这与RNAi研究的结果一致。此外,我们发现,RNAi对CDK9表达的缺失可以消除HSV诱导的Rpb-1磷酸化以及HSV感染(图7C). 重要的是,这两种治疗方法都消除了JQ1对HSV感染的增强作用(图7D和7E). 这些结果共同证明BRD4通过募集病毒基因表达的转录因子来调节HSV感染。BD1抑制剂通过将这些因子更有效地作用于病毒基因转录位点来增加HSV感染。

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HSV-1感染对CDK9激酶活性的要求。

(A) JQ1治疗促进HSV-1感染并增加Rbp-1/RNAP II的磷酸化。在不存在或存在300nM JQ1的情况下,用HSV-1(1MOI)感染HeLa细胞24小时。通过免疫印迹使用特异性抗体测定蛋白质表达和修饰。下面板条形图表示相对于GAPDH的ICP0和磷酸化Rpb-1带强度的定量测量。(B) CDK9抑制剂LDC000067(LDC)剂量依赖性地阻断Rbp-1磷酸化(上面板)和病毒基因表达,分别通过western blotting和qPCR测定。(C) 通过western blotting和qPCR分别检测到CDK9表达的敲除阻断Rbp-1磷酸化和病毒基因表达。(D) CDK9抑制剂LDC000067(LDC)消除了JQ1对Rbp-1磷酸化和HSV-1基因表达的影响。(E) 敲低CDK9表达可减弱JQ1对Rbp-1磷酸化和病毒基因表达的影响。

讨论

人类单纯疱疹病毒是疱疹病毒科的成员,能够在上皮细胞中进行生产性感染循环。病毒还能够在感觉神经元中建立潜伏期。上皮细胞感染后,病毒核衣壳沿着微管运输到核孔,将病毒基因组释放到细胞核中。线状病毒DNA在细胞核内快速循环,并经历常染色质的染色和修饰[7835]. 这些修饰与病毒基因转录有关,因为蛋白质甲基化的抑制降低了病毒基因的表达[1136]而促进组蛋白乙酰化的试剂可增强病毒复制[37]. 通过筛选表观遗传学化合物库,我们发现了几种促进HSV感染的溴代多巴胺抑制剂。这些化合物调节染色质乙酰化过程,因为它们阻止染色质阅读器与乙酰化染色质结合并干扰组蛋白修饰。与HDACi通过增加组蛋白乙酰化促进HSV复制不同,JQ1治疗不影响组蛋白修饰的模式(图DS1文本). 该效应与c-Myc抑制c-Myc无关(图BS1文本). 相反,我们的数据支持BRD4调节HSV复制的模型(图8). HSV感染诱导BRD4与病毒基因转录转录调控机制的组成部分相关。BD1结构域抑制剂如JQ1将BRD4从细胞染色质中移除,因此可以促进这种关联,导致蛋白质复合体重新定位到病毒基因启动子以实现更有效的复制。

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BRD4调节单纯疱疹病毒复制的模型。

BRD4通过识别乙酰赖氨酸残基及其溴代代谢物(BD1,BD2)参与表观遗传调控。BRD4还通过招募正转录延伸因子(P-TEFb)和转录因子来调节细胞和病毒基因的转录。P-TEFb本身受到抑制性7SK小核核糖核蛋白(7SK-snRNP)复合物的严格控制。HSV-1或HSV-2感染导致BRD4重新定位,并使BRD4和蛋白复合物重新指向病毒基因转录。JQ1(红点)或BD1结构域蛋白通过从染色质结合中去除BRD4而发挥作用。

转录延长已被认为是信号诱导型基因表达的限速步骤。通过招募正转录延伸因子P-TEFb,含溴蛋白BRD4在调节多种细胞过程和反应的大量基因的转录延伸中发挥关键作用[38]. 在这里,我们表明溴代多巴胺抑制导致BRD4与病毒基因启动子的增强关联,强调了BRD4在HSV感染中的重要性,这与以前的观察一致,因为病毒有能力通过将宿主Pol II转录机制转移到病毒基因组来抑制宿主转录[3940]. 普遍表达的BRD4是一种表观遗传读取器和转录调节器,在有丝分裂期间标记活性基因,并作为转录因子的支架[41——45]. 我们发现BRD4将包括CDK9在内的转录因子招募到病毒基因启动子中,这可能导致HSV-1基因表达的优化[334647]. BRD4被证明在有丝分裂过程中作为细胞适配器保留HPV基因组[16]对病毒DNA复制至关重要[15]. BRD4阻止转录调节器向病毒基因启动子招募HPV和HIV-1潜伏期[4348——50]. BRD4缺失或抑制增加HIV-1复制[18]. JQ1通过拮抗BRD4对Tat-转化的抑制,重新激活HIV潜伏期[183251——53]. 确定JQ1或BRD4是否在HSV再激活中发挥作用将是令人感兴趣的。尽管如此,本研究证明BRD4在表观遗传调控和病毒复制中是双重功能蛋白。

众所周知,六亚甲基二乙酰胺(HMBA)是一种有效的肿瘤细胞分化诱导剂,能够增强HSV的复制[54——56]. 该机制尚未确定。其据称对病毒基因表达动力学的作用模式的一个独特特征是,这种作用是短暂的,需要在感染后早期使用VP16-null突变株短时间接触该药物(1.5到5小时)[5557]. 各种信号事件、紫外线或化学物质(如HMBA)导致P-TEFb从其抑制装置中瞬时释放,导致宿主基因转录[5859]. P-TEFb被小核核糖核蛋白(7SK-snRNP)隔离,在静止细胞中保持不活动[6061]. 急性反应和细胞生长所需的游离P-TEFb可以通过超延伸复合物(SEC)、BRD4或转录因子被招募到RNAP II。我们表明,JQ1处理增强了涉及BRD4-P-TEFb-RNAP II的复杂形成。HMBA和JQ1在促进HSV复制方面可能有共同的机制。

通过筛选表观遗传学化合物库,发现了促进HSV感染的化合物。筛选具有明确靶点的化合物库的一个明显优势是,它可以轻松快速但明确地分离HSV感染等生物事件,因为这些结构多样的化合物用作相互交叉验证的探针。BRD4作为HSV裂解感染的重要因子的鉴定为抗病毒药物研究提供了一个新的靶点。BET抑制剂目前用于肿瘤治疗[6263]. 我们的结果提出了这样一个问题,即这些药物可能会加剧现有的疱疹感染。最近,一种溶瘤疱疹病毒被批准用于某些肿瘤的治疗,尽管如此,JQ1和类似化合物可能在溶瘤HSV载体的肿瘤治疗中有潜在的应用。

材料和方法

细胞和病毒

Vero细胞系(非洲绿猴肾上皮细胞,ATCC CCL-81)、HeLa细胞系(ATCC,CCL-2)、HEp-2细胞系(ATMC,CCL-23)和人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞(ATCC、HTB-11)购自ATCC(弗吉尼亚州马纳萨斯)或中国科学院细胞库(中国上海)。小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)细胞(从C57BL/6J小鼠胚胎中分离)是按照已公布的方案在实验室制备的[64]. 在37°C、5%CO的加湿培养箱中,在补充有10%热灭活胎牛血清(FBS)、丙酮酸钠和非必需氨基酸(加利福尼亚州卡尔斯巴德市生命科技公司)的DMEM(高糖)中培养细胞2HSV-1菌株F和HSV-2菌株G在Vero细胞上增殖和滴定。

试剂和抗体

表观遗传学化合物库(目录号L1900)购自Selleck Chemicals China(上海)。该文库包含表观遗传酶的细胞渗透性抑制剂,包括组蛋白去乙酰化酶(HDACi)、赖氨酸去甲基化酶、组蛋白乙酰转移酶(HAT)、DNA甲基转移酶(Dnmts)和表观遗传阅读域抑制剂。曲古菌素A(TSA)、PFI-1、JQ1、TG101348、RVX-208和LDC000067(CDK9抑制剂)也从Selleck Chemicals购买。(-)-JQ1购自MedChem Express。BRD4(Abcam,ab128874)、CDK9(Santa Cruz,sc-13130)、Rpb-1 CTD(Cell Signaling Technology,2629)、磷酸化Rpb1 CTD(细胞信号技术,13546,Ser2/Ser5特异性)、c-Myc(生物世界技术,BS2462)、组蛋白H3(Beyotime Institute of Biotechnology,AH433)、磷酸氢istone H3(Cell信号技术,3377,ser10)、,乙酰化组蛋白H3(Millipore,DAM1776434,Lys9/Lys14)、GAPDH(Bioworld Technology,MB001)已商业化获得。使用商业来源在新西兰兔体内制备了抗ICP4(HSV-1和-2;GenScript,南京)和抗ICP0(HSV-2和HSV-1;ABmart,上海)的抗血清。辣根过氧化物酶(HRP)缀合的第二抗体购自Bio-Rad。Alexa Fluor 488(绿色)缀合的抗小鼠IgG和Alexa Fluor 568(红色)缀合的抗兔IgG购自Life Technologies。蛋白G琼脂糖珠购自罗氏诊断公司。

化合物筛选和病毒感染分析

如前所述,我们首先使用MTT法测定化合物对Vero细胞的细胞毒性作用[65]. 为了筛选其对HSV感染的活性,将一种受试化合物的二甲基亚砜库存新鲜稀释到培养基中,并在接种前2小时以最大无毒浓度一式三份进行测试。使用1MOI的HSV-2进行筛选。在整个感染过程中,0.1-0.2%的化合物或二甲基亚砜留在培养基中。我们使用MTT法在48–60小时PI下测量细胞存活率,以快速测量HSV感染对细胞病变的影响。如果化合物对HSV感染有选择性作用,则进行斑块形成试验(PFU)。

DNA和转染

pCMV2-FLAG-BRD4购自Addgene(#22304)。质粒编码全长BRD4(NM_058243号)用于哺乳动物表达[49]. 使用分子生物学标准协议,将BD1(aa 1–196)、BD1/2(aa 1-640)和BD1缺失(ΔBD1,aa 197–1362)对应的DNA插入p3xFLAG-CMV-24(Sigma)。在转染研究中,使用Lipifectamine 2000(Life Technologies)转染DNA。细胞转染后24小时用于不同的检测。

rna干扰

以人BRD4或CDK9为靶点的小干扰RNA(siRNA)寡核苷酸由GenePharma(中国上海)合成。对于基因敲除实验,在转染前24小时将细胞置于6孔板或24孔板(Corning)中。使用Lipofectamine 2000转染细胞。细胞转染后48–72小时用于进一步实验。

BRD4-siRNA#1:5'-CUCCCUGAUUACUAUAAGATT-3’和

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BRD4-siRNA#2:5'-GGAGAGACAUAGUCUUAATT-3'和

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BRD4-siRNA#3:5'-GCACAUCAGUCUAAAACUTT-3'和

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BRD2-siRNA#1:5'-CACGAAAGCUACAGGAUGU-3'和

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BRD3-siRNA#1:5'-AAUUGAACCUGCCGGAUA-3'和

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BRD3-siRNA#2:5'-CGGCUGAUGUUCUCGAAUU-3'和

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c-Myc-siRNA#1:5'-ACGGACUCUUGUGCGUAA-3'和

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c-Myc-siRNA#2:5'-GAACACACACACGUCUUGGA-3'和

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CDK9-siRNA#1:5'-GGAGAAUUUUACUGUUUdTdT-3'和

5'-AAACACAGUAAAAUUCCdTdT-3'

CDK9 siRNA#2:5'-CCGCUGCAAGGGUAUADTDT-3'和

5'-UAUACUACCCUGCAGGdTdT-3'

CDK9-siRNA#3:5'-UAGGGACAUGAAGGCUGCUAAAdTdT-3'和

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免疫沉淀和western印迹分析

细胞裂解后,使用含有50mM Tris-HCl(pH 7.4)、150mM NaCl、1%NP-40和蛋白酶抑制剂混合物(Roche)的缓冲液离心收集细胞裂解物。对于免疫沉淀研究,细胞裂解物与捕获抗体或对照抗体在4°C下孵育2小时,然后与蛋白G-琼脂糖珠孵育过夜。通过离心收集免疫复合物,然后用冰镇PBST(PBS-0.02%吐温-20)洗涤,并用SDS-PAGE分离。

染色质免疫沉淀(ChIP)分析

进行改良的ChIP分析以确定蛋白质和病毒DNA的相互作用[66]. 简单地说,HSV-1感染细胞(2x107)用冰镇PBS清洗三次,然后用1%甲醛交联。通过添加甘氨酸(125 mM)来终止反应。用冰镇PBS冲洗后,将细胞收集到含有5 mM PIPES(pH 8.0)、1%十二烷基硫酸钠、1 mM EDTA和蛋白酶抑制剂的细胞裂解缓冲液中。混合物在冰上孵育15分钟,然后在15秒开和10秒关的周期中以30的振幅进行超声处理20分钟,以剪切DNA。通过离心收集上清液,并立即使用或储存在-80°C下。对于免疫沉淀,使用ChIP稀释缓冲液(Beyotime)稀释上清液,并使用鲑鱼精子DNA/蛋白G琼脂糖珠(Roche)进行预处理。蛋白-DNA复合物与指示抗体和蛋白G珠在4°C下沉淀过夜。用缓冲液a中含有150 mM NaCl的低盐缓冲液(2 mM EDTA,1%Triton X-100,0.1%SDS,20 mM Tris-HCl,pH 8.1)清洗免疫复合物,然后用高盐缓冲液清洗(缓冲液a内500 mM NaCI),然后用LiCl清洗缓冲液(250 mM LiCl,1 mM EDTA,1%NP-40,1%脱氧胆酸盐,10 mM Tris-HCl,PH8.1)。用洗脱缓冲液(1%SDS,0.1 M NaHCO)洗脱络合物3). 用10μg/ml RNase A处理去除污染RNA。然后在65°C下培养复合物过夜以逆转交联,然后在55°C下用蛋白酶K培养1小时以去除蛋白质。通过苯酚-氯仿萃取纯化DNA,然后进行乙醇沉淀,并使用实时和PCR分析DNA-蛋白关联。引物列于S1表.

RT-PCR和实时PCR检测

对于RT-PCR研究,使用TRIzol试剂(生命技术)提取总RNA。使用AMV逆转录酶将一微克RNA逆转录成cDNA。使用SYBR Green PCR Master Mix(Q141-02/03,Vazyme,中国南京)在ABI 7300实时PCR系统(Applied Biosystems)上进行实时PCR,并使用2-ΔΔCt获得相对丰度的方法[67]. GAPDH Ct水平被用作值标准化的内部控制。

免疫荧光和共焦显微镜分析

在盖玻片上培养的细胞在室温下用4%多聚甲醛固定10分钟(RT)。用0.2%Triton X-100处理细胞10分钟,使其在RT下渗透。用正常山羊血清封闭细胞30分钟,然后用BRD4抗体(1:500稀释度)、Rpb-1抗体(1:700稀释度)或CDK9抗体(1:50稀释度)在4°C下孵育过夜。Alexa Fluor结合二级抗体(1:1000)用于可视化。细胞核用1μg/ml DAPI染色10分钟。在Olympus FluoView FV10i共焦显微镜上收集图像。

HSV基因组标记和点击化学研究

我们使用EdU掺入法测量病毒基因组复制[28]. 简单地说,在玻璃盖玻片上生长的HeLa细胞在含有0.5%FBS的DMEM中缺血清24小时,以将细胞阻滞在G0阶段。然后用HSV-1以10 PFU/细胞感染细胞4小时,然后用含有2%FBS和5μM EdU的新鲜DMEM替换培养基,再培养4小时。使用Click-iT EdU成像试剂盒(Life Technologies)通过与Alexa Fluor 488叠氮化物反应结合EdU标记的DNA。细胞核用DAPI染色。共聚焦显微镜检测BRD4重分布。

统计分析

使用SPSS 17.0软件包进行统计分析。数据采用配对T检验进行分析。P值等于或小于0.05被认为具有统计学意义。

支持信息

S1文本

图A.溴代主要抑制剂对不同细胞HSV-1和HSV-2感染的影响用0.1%二甲基亚砜(模拟,溶剂对照)的试验化合物处理6孔板中的细胞2小时。使用的浓度如下:JQ1,300 nM;PFI-1500毫微米;TSA,150 nM;(-)-JQ1,300 nM。然后用HSV-1或HSV-2在1个MOI下感染细胞24小时。通过Vero细胞上的菌斑试验测定病毒生成。(A) HeLa细胞。(B.HEp-2细胞。(C)SK-N-SH细胞。(D) 小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)。图B.抑制c-Myc表达对HSV感染没有影响。(A) 用靶向BRD4或c-Myc的siRNA处理HeLa细胞48小时,或用JQ1处理24小时。以GAPDH为对照,通过qPCR测定c-Myc水平。(B,C)通过siRNA直接或通过BRD4抑制或JQ1(300 nM)治疗间接抑制C-Myc,并不影响HSV-1感染或JQ2对HSV-1和HSV-2感染的影响。对于感染检测,在感染前用siRNA处理细胞48小时。si-cMyc/JQ1:在si-cMyc处理细胞的病毒感染期间添加300 nM的JQ1。图C.用于ChIP分析的寡聚物的选择性。A.用于ChIP分析和对照的配对引物示意图。转录起始点(TSS)用红色箭头标记。针对ICP0、ICP4和gB的启动子区域(PR)、上游非促性腺激素区域(UNPR)和下游非促性腺素区域(DNPR)的寡核苷酸用于研究。寡核苷酸序列列于S1表B.分别在超声波作用10分钟(通道1)和20分钟(通道2)后对DNA片段进行琼脂糖凝胶电泳。研究中使用了2号车道的样本。C.样品用抗BRD4抗体免疫沉淀。使用靶向启动子区(PR)、上游非促性腺激素区(UNPR)或下游非促性子区(DNPR)的寡核苷酸扩增BRD4相关病毒DNA。图D.JQ1没有引起组蛋白修饰。对HeLa细胞进行溶剂处理(模拟,0.1%二甲基亚砜),在300 nM的条件下用JQ1处理,在没有(HSV-1)或存在300 nM JQ1(H+J)的条件下感染HSV-1(1 MOI)。作为积极因素,包括150 nM的TSA。将样本处理或感染24小时。免疫印迹法检测组蛋白-3乙酰化(Ac-H3)、血清-10磷酸化(p-H3)以及病毒ICP0和ICP4蛋白表达。GAPDH被用作负载控制。

(畅通节能法)

S1表

用于基因检测的引物对列表:

(DOCX)

致谢

作者感谢Grace Zhou博士和Dwayne Stupack博士的评论和激励性讨论,并感谢Changmai Chen和Hengfei Shi提供的技术援助。

资金筹措表

这项工作得到了国家自然科学基金的资助(81121062、81371772,国家自然科学基金会网站www.nsfc.gov.cn). 资助者在研究设计、数据收集和分析、决定出版或编写手稿方面没有任何作用。

数据可用性

所有相关数据都在论文及其支持信息文件中。

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文章来自多囊卵巢综合征病原体由提供多环芳烃