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电流原蛋白科学。作者手稿；PMC 2015年8月6日发布。
以最终编辑形式发布为：
电流原蛋白科学。2013; 73：单位：9.9。
2013年9月24日在线发布。 数字对象标识：10.1002/0471140864.ps0909s73
PMCID公司：项目经理4527311
美国国立卫生研究院：美国国立卫生研究院710351
采购管理信息：24510596

蛋白质纯化亲和标签综述

米歇尔·金普,1,* 艾莉森·布里尔,1和蕾妮·帕斯克1
作者信息 版权和许可信息 PMC免责声明

早期亲昵标签

第一个使用的亲和标签是几乎专门用于蛋白质表达和纯化的大蛋白大肠杆菌其中一个标签，葡萄球菌蛋白A，长度为280个氨基酸，由于其相对较大的尺寸和蛋白水解稳定性，可以增加异源蛋白的溶解度和/或表达(Sambrook等人，1989年). 蛋白A融合物可通过IgG Sepharose（Kd日=10nM），并用低pH缓冲液洗脱(9.5号机组)或蛋白酶；然而，标签的大尺寸和/或低pH洗脱会导致融合蛋白变性和活性丧失，从而改变其功能活性。蛋白酶回收可以将标记的蛋白质自身裂解，从而产生相同的结果。此外，融合蛋白与IgG的结合使免疫学分析复杂化，因此蛋白A融合不适合用作免疫学试剂。

回收技术的最新进展提高了从IgG Sepharose中分离蛋白A及其活性形式的相关蛋白复合物的能力。Bio-Ox是FcIII肽的生物素化形式，利用其对IgG（K）的高亲和力d日=11毫微米）(Strambio-de-Castilia等人，2005年). Bio-Ox与蛋白A竞争结合IgG，有效洗脱重组蛋白。生物素的添加增加了FcIII的溶解度，而不影响肽本身的结合亲和力(Strambio-de-Castilia等人，2005年)因此是纯化天然形式的蛋白A融合物的理想洗脱方法。GE Healthcare Life Sciences提供商业系统(表9.9.1).

表9.9.1

蛋白质亲和标签的特性

标签长度（se-
序列）		职位基质/洗脱商业系统
（供应商）		典型用途评论请参阅-
nces公司
白蛋白结合蛋白（ABP）137N项或C项白蛋白/低pH值或变性（例如，加热、尿素）不适用纯化、增加表达和增加溶解度可以增加融合蛋白的蛋白水解稳定性以增加表达；可提高熔融溶解度；真核系统中与白蛋白的高背景结合；矩阵的可重用性有限；大标记或低pH洗脱条件可能会影响融合特性Nilsson等人（1997年a）
碱性磷酸酶（AP）444伯胺（赖氨酸侧链ε-胺和N端α-胺）mAb/低pHEasyLink碱性磷酸酶结合试剂盒（AbCam）；Lightning-Link™碱性磷酸酶试剂盒（Innova）；gWIZ分泌型AP表达载体（Genlantis）检测和净化比色检测；用于细菌和哺乳动物表达系统中的蛋白质印迹、远西方印迹、南方印迹、夹心ELISA和亚细胞定位；细菌周质粗提物的简便纯化；抗体纯化不产生高产量；低pH洗脱可能不可逆地影响蛋白质性质；矩阵的可重用性有限；AP二聚化和大尺寸可能影响融合特性。Lazzaroni等人（1985年）
AU1表位6（DTYRYI）N项或C项单克隆抗体/低pH表位标记肽，AU1试剂盒（Covance）检测和净化抗体纯化不产生高产量；低pH洗脱可能不可逆地影响蛋白质性质；矩阵的可重用性有限Goldstein等人（1992年）
AU5表位6（TDFYLK）N项或C项单克隆抗体/低pH表位标记肽，AU5试剂盒（Covance）检测和净化抗体纯化不产生高产量；低pH洗脱可能不可逆地影响蛋白质性质；矩阵的可重用性有限克雷斯波等人（1997）
噬菌体T7表位（T7-tag）11（MASMTGQQMG）N项或内部单克隆抗体/低pHT7-tag亲和纯化试剂盒（EMD Millipore）纯化和增加表达噬菌体T7基因10的N端11个氨基酸；可能增加融合蛋白的表达；抗体纯化不产生高产量；低pH洗脱可能不可逆地影响蛋白质性质；矩阵的可重用性有限Makrides（1996）
噬菌体V5表位（V5-tag）14（GKPIPNPLLGLDST）C术语不适用选定的pET定向TOPO、pBAD和网关系统（生命技术）；V5标签肽和单克隆抗体（AbCam）检测简短的线性识别基序；细菌裂解物中的抗体特异性，尽管哺乳动物裂解物中存在一些交叉反应性；通常与His-tag结合用于蛋白质纯化McLean等人（2001年）
生物素-羧基载体蛋白（BCCP）100N项或C项亲和素或链霉亲和素/生物素或变性（如热、尿素）精确定位系统（Promega）；展开图®抗体阵列（Sigma-Aldrich）检测、纯化和固定标签被生物素化体内；融合蛋白的一步纯化；可以分泌蛋白质以便于纯化；生物素标签可用于将融合固定到链球菌素涂层表面，例如表面等离子体共振（SPR）芯片；真核系统中与亲和素的高背景结合；生物素洗脱可能效率低下；变性洗脱需要融合蛋白的复性；Promega SoftLink抗生物素是PinPoint系统的一部分，可在温和条件下洗脱Nilsson等人（1997年b）
蓝舌病毒标签（B-tag）6（QYPALT）N项或C项单克隆抗体/低pH不适用检测和净化蓝舌病毒VP7区；抗体纯化不会产生高产量；低pH洗脱可能不可逆地影响蛋白质性质；矩阵的可重用性有限Wang等人（1996）
钙调素结合肽（CBP）26N项或C项钙调素/EGTA或EGTA和高盐亲和蛋白表达与纯化系统（安捷伦科技）纯化和表达相对较短的识别基序；无内源性大肠杆菌结合钙调蛋白的蛋白质；PKA目标序列允许32P标记；高收率基质与还原剂和洗涤剂相容，但重复使用性有限；不适用于从真核细胞中纯化；N端的标签可能会降低翻译效率Terpe（2003）
氯霉素乙酰转移酶（CAT）218N项氯霉素/氯霉素gWiz™载体高表达载体（Genlantis）检测、纯化和增加溶解度酶法可用于蛋白质定量；氯霉素纯化不产生高产量，大标签可能影响融合蛋白的性质Podbielski等人（1992年）
纤维素结合域（CBP）27–189N项、C项或内部（依赖于域）纤维素/变性（I类CBD）或乙二醇（II类或III类CBDs）pCAL-n、pCAL-n-EK、pCAL-n-FLAG和pCAL-c矢量集（安捷伦科技）纯化、分泌和固定一些CBD与固定化用纤维素的不可逆结合；对纯化有用的CBDⅠ、Ⅱ和Ⅲ家族的可逆结合；Ⅰ族CBD融合蛋白的纯化需要蛋白质重折叠；纯化的系列II CBD融合必须进行缓冲交换Terpe（2003）
甲壳素结合域（CBD）51N项或C项甲壳素（当与intein融合时）/含硫醇的还原剂（例如DTT或β-ME）IMPACT系统（新英格兰生物实验室）净化通常与自拼接intein标签结合使用；一步纯化近100%纯蛋白质，毫克产量低；与高盐和非离子洗涤剂相容的基质；在洗脱步骤之前，必须在没有硫醇还原剂的情况下进行净化；融合蛋白可能影响内含子的切割效率Terpe（2003）
胆碱结合域（CBD）145N项胆碱/胆碱或CBD肽LYTAG双相蛋白纯化（微溶）纯化和固定化N项CBD可将融合蛋白固定在胆碱涂层金芯片上，用于SPR或显微镜研究；大标签或C项标签的放置可能影响融合蛋白Jones等人（1995）
二氢叶酸还原酶（DHFR）227N项或C项甲氨蝶呤/叶酸pQE向量集（Qiagen）表达增加可增加融合蛋白的蛋白水解稳定性以增加表达；小鼠和大鼠的免疫原性很低，因此有助于产生融合抗体；甲氨蝶呤提纯不产生高产；通常与短亲和标记（例如His-tag、Strep-tag）结合用于纯化Morandi等人（1984年）
E2表位10（SSTSSDFRDR）N项、C项或内部单克隆抗体/低pHE2-标签和检测试剂盒（Abcam）检测和净化来源于牛乳头瘤病毒1型反式激活蛋白E2；可用于比色和化学发光检测的一级抗体；抗体纯化不产生高产率，低pH洗脱可能会不可逆地影响蛋白质性质；矩阵的可重用性有限Kaldalu等人（2000年）
FLAG表位8（DYKDDDK）N项或C项单克隆抗体/低pH值、EDTA或FLAG肽FLAG系统（Sigma-Aldrich）检测和净化简短的线性识别基序；一步法生产中等纯度蛋白质；肠激酶在C-末端赖氨酸裂解后完全去除标签，这取决于融合的第一个氨基酸的身份；M1抗体只能在N项结合标签；抗体纯化不产生高产量；低pH洗脱可能不可逆地影响蛋白质性质；矩阵的可重用性有限Terpe（2003）
半乳糖结合蛋白（GBP）509N项或C项半乳糖/半乳糖不适用净化和增加溶解度融合蛋白可靶向周质，以方便纯化周质粗提物；可能增加融合蛋白的溶解度；大标签可能影响融合蛋白的性质Jones等人（1995）
绿色荧光蛋白（GFP）220N项或C项不适用phCMV融合稳定报告载体（Genlantis）；CT-GFP公司
Fusion TOPO克隆工具包（生命技术）；gWIZ GFP哺乳动物表达载体（Genlantis）		检测固有荧光可以实现无抗体的自然检测；特异性抗GFP抗体；在原核和真核表达系统以及整个生物体（例如，蠕虫、植物、小鼠）中的表达；有助于通过FRET监测基因表达、蛋白质折叠和靶向，以及蛋白质-蛋白质相互作用；一些非特定靶向核的GFP融合；非常大的标签或GFP二聚体可能影响融合特性Gerdes和Kaether（1996）
Glu-Glu（EE-tag）6（EYMPME或EFMPME）N项、C项或内部单克隆抗体/低pH或30°C培养表位标记肽，GLU-GLU试剂盒（Covance）检测和净化简短的线性识别基序；现有抗体仅识别EYMPME基序；抗体纯化不产生高产率，低pH值或30°C洗脱可能对蛋白质性质产生不可逆转的影响；矩阵的可重用性有限Rubinfeld等人（1991年）
谷胱甘肽S-转移酶（GST）211N项或C项谷胱甘肽/还原型谷胱甘苷pGEX系统（GE Healthcare）；GST•Bind™系统（EMD Millipore）检测、纯化、增加表达、增加溶解度和固定化非常常见的纯化标签；相对纯净蛋白质的一步纯化；检测抗体特异性；GST融合蛋白通用试剂盒（例如SPR、酶分析）；矩阵相对可重复使用（四到二十次）；GST具有高度抗原性；仅在自然条件下净化；一些GST融合物不溶；GST二聚和/或谷胱甘肽洗脱可能影响融合蛋白的特性史密斯（2000）
人流感血凝素（HA）31N项、C项或内部单克隆抗体/低pH或HA肽HA-tag向量集（Clontech）；μMACS和multiMACS HA隔离试剂盒（Miltenyi Biotec）检测和纯化抗-HA抗体特异性；在哺乳动物表达系统中有用；抗体纯化不产生高产量；低pH洗脱可能不可逆地影响蛋白质性质；矩阵的可重用性有限Tai等人（1988年）
HaloTag®（卤代标签）312N项或C项HaloLink™树脂/HaloTag®缓冲液和TEV蛋白酶HaloTag®蛋白质纯化系统（Promega）纯化、增加溶解度和表达每个不同的实验必须购买不同的配体；严格的清洗条件可能会影响熔合性能；在活细胞中快速工作Los等人（2008）
组氨酸亲和标签（HAT）19（KDHLIHNVHHKEFHAHNK）N项或C项二价金属（Ni2+，公司2+，铜2+，或锌2+)/咪唑或低pH值HAT蛋白表达和纯化系统（克隆泰克）净化发现螯合二价金属的天然蛋白质序列；短识别基序；含有六种组氨酸，散布在其他氨基酸中；半纯蛋白一步法；矩阵可以几乎无限地再生和重用；不能像His-tag那样紧密地结合金属亲和树脂；标签或洗脱条件可能影响融合特性Terpe（2003）
辣根过氧化物酶（HRP）400伯胺（赖氨酸侧链ε-胺和N端α-胺）不适用EZ-Link Plus活性过氧化物酶和试剂盒（Pierce）检测化学发光检测；用于Western blotting、夹心ELISA和免疫组织化学；不推荐作为蛋白质纯化标签。Imagawa等人（1982年）
单纯疱疹病毒表位11（QPELAPED）C术语单克隆抗体/低pHHSV•标签®套件（EMD Millipore）净化仅C-term标签放置；抗体纯化不产生高产量；低pH洗脱可能不可逆地影响蛋白质性质；矩阵的可重用性有限Fritze和Anderson（2000）
酮类异构酶（KSI）125N项不适用pET-31b（+）载体（EMD Millipore）表达增加不溶性蛋白质靶向包涵体；通常与短亲和标记（His-tag，Strep-tag）结合用于纯化有毒蛋白质，但需要进行复性库利奥普洛斯和沃尔什（1994）
KT3表位11（KPPTPPPEPET）N项或C项单克隆抗体/低pH不适用检测和净化短的线性识别基序；抗体纯化不产生高产量；低pH洗脱可能不可逆地影响蛋白质性质；矩阵的可重用性有限Kwatra等人（1995年）
LacZ公司1024N项或C项APTG/高pH硼酸盐缓冲液LacZ和Beta-Gal载体和检测试剂盒（Clontech）；gWIZβ-半乳糖苷酶哺乳动物表达载体（Genlantis）检测、纯化和增加表达也称为β-半乳糖苷酶或β-gal；酶法可用于蛋白质定量；可增加融合蛋白的蛋白水解稳定性，增加表达；融合蛋白可能不溶；在溶液中形成四聚体的超大标签，可能影响融合蛋白的特性Tai等人（1988）
荧光素酶551N项不适用gWIZ荧光素酶哺乳动物表达载体（Genlantis）；荧光素酶分析系统（Promega）检测发光；翻译后可以立即担任记者；适用于涉及原位杂交、RNA处理、RNA转染或耦合体外转录/翻译、蛋白质折叠和成像的研究；可以标记为35S；为了保持酶的活性，从N或C项中删除的密码子不能超过五个；标签过大可能会影响融合的特性卡普和奥克布洛姆（1999）
麦芽糖结合蛋白（MBP）396N项或C项交联直链淀粉/麦芽糖矢量融合辅助MBP试剂盒（矢量实验室）；pMAL系统（新英格兰生物实验室）检测、纯化、增加表达和增加溶解度相对纯蛋白质的一步纯化（>70%）；基质与非电离洗涤剂和高盐相容，但不与还原剂相容；能增加真核蛋白在细菌中的表达；抗MBP抗体特异性；N项标记会降低翻译效率；标签尺寸过大可能会影响融合蛋白的特性Nilsson等人（1997年b）,Terpe（2003）
Myc表位11（CEQKLISEEDL）N项、C项或内部单克隆抗体/低pHpDual Expression System（安捷伦科技）；pET Express&Purify试剂盒（Clontech）检测和净化简短的线性识别基序；抗myc抗体有点混杂；抗体纯化不产生高产量；低pH洗脱可能不可逆地影响蛋白质性质；矩阵的可重用性有限Kolodziej和Young（1991）
NusA公司495N项或C项不适用pET NusA融合系统（EMD Millipore）增加表达和溶解度反转录终止因子；增加融合蛋白的溶解度和表达；必须与用于蛋白质纯化的另一个亲和标签结合使用；大标签可能影响融合蛋白的性质Terpe（2003）
PDZ域80–90N项、C项或内部固定化C末端PDZ配体序列/还原剂（InaD PDZ1）不适用检测、纯化和固定简短的线性识别基序；PDZ-配体相互作用可以非常特异和高亲和力；减少洗脱可能会破坏融合蛋白的特性Kimple和Sondek（2002）
PDZ配体5–7（变化）C术语固定化PDZ结构域/还原剂（NorpA C末端）不适用检测、纯化和固定简短的线性识别基序；PDZ-配体相互作用可以非常特异和高亲和力；减少洗脱可能会破坏融合蛋白的特性；标记必须位于C末端才能绑定到PDZ域Kimple和Sondek（2002）
多精氨酸（精氨酸-标记物）5-6（通常为5；RRRRR）C术语阳离子交换树脂/高pH盐梯度不适用纯化和固定化可将目标固定在云母上用于显微镜研究；短线性再认母题；一步到位的纯蛋白质；带电标签可能影响蛋白质的三级结构和/或蛋白质性质；羧肽酶B裂解标签的成功率有限Terpe（2003）
聚天冬氨酸盐5–16日（DDDDD）C术语阴离子交换树脂/低中性pH盐梯度不适用净化简短的线性识别基序；极性标签可能影响蛋白质的三级结构和/或蛋白质特性史蒂文斯（2000）
多胱氨酸（Cys-tag）4（CCCC）N项含硫丙基-Sepharo sethiol的还原剂（例如，DTT，β-ME）不适用净化简短的线性识别基序；一步法生产中等纯度蛋白质；在洗脱步骤之前，必须在没有硫醇还原剂的情况下进行净化；减少洗脱可能会破坏融合蛋白的特性史蒂文斯（2000）
聚组氨酸（His-tag）2–10（通常为6；HHHHH）N项或C项二价金属（即镍2+，公司2+，铜2+，或锌2+)/咪唑或低pH值QIAexpress系统（Qiagen）；选定的pET定向TOPO、pBAD和网关系统（生命技术）检测、纯化和固定最常见的净化标签；短的线性识别基序；根据融合蛋白的表达水平，一步纯化20%～80%的纯蛋白；变性纯化可能；矩阵可以无限期地再生和重用；可用于将融合固定到Ni-NTA SPR芯片上，但显著分离使数据分析复杂化；标记或洗脱可能影响蛋白质性质；检测高度混杂的抗体Bornhorst和Falke（2000年）
苯丙氨酸（苯丙氨酸）11（ffffffffffff）N项苯基-脑葡萄糖/乙二醇不适用净化简短的线性识别基序；一步法生产中等纯度蛋白质；非极性标签或乙二醇洗脱可能破坏融合蛋白的特性史蒂文斯（2000）
Profinity eXact软件75N项固定化枯草杆菌蛋白酶/氟化物缓冲液和成熟枯草杆菌酶Profinity eXact™Fusion-Tag系统（Bio-Read）表达和纯化快速、一次性纯化和切割（30分钟）；列可以无限期地重新生成；温和的洗脱条件不会影响融合特性；已证明对异源三聚体G蛋白起良好作用Abdulaev等人（2005年），Biao等人（2004），Ruan等人（2004）
蛋白质C12N项或C项单克隆抗体/钙2+缓冲器蛋白质C表位标记系统（罗氏）检测和纯化简短的线性识别基序；抗PC抗体与钙结合2+-依赖方式；钙洗脱2+在生理缓冲条件下；抗体纯化不能产生高产量Fritze和Anderson（2000）
S1-标签9（NANNPDWDF）N项或C项单克隆抗体/低pH不适用检测和净化乙型肝炎病毒S1区；短的线性识别基序；AP1抗体特异性；已在细菌和哺乳动物表达系统中进行测试；一步合成相对纯净的蛋白质；抗体纯化不会产生高产率，低pH洗脱可能会对蛋白质特性产生不可逆的影响，基质的重复使用性有限贝洛特（1999）
S标签15（KETAAAKFERQHMDS）N项、C项或内部核糖核酸酶A S片段/低pHS•Tag™净化试剂盒（EMD Millipore）检测和净化简短的线性识别基序；核糖核酸酶S分析可用于定量检测表达水平；用于无抗体检测的比色分析；tag或低pH洗脱可能不可逆地影响蛋白质性质；矩阵的可重用性有限Fritze和Anderson（2000）
链球菌素结合肽（SBP）38C术语链球菌抗生物素/生物素SBP细菌系统表达载体（Sigma-Aldrich）纯化和固定化相对较短的识别基序；将蛋白质固定在各种介质中（例如，链球菌素涂层珠、SPR芯片）；仅C项标记Terpe（2003）
葡萄球菌蛋白A（蛋白A）280N项IgG/低pH或IgGpEZZ 18和pRIT2T载体（GE Healthcare）净化和增加溶解度蛋白质水解稳定；可能增加融合的溶解度；分泌融合蛋白；提纯不产生高产量；标签尺寸大和/或pH值低的洗脱可能会不可逆地影响蛋白质特性；矩阵的可重用性有限Nilsson等人（1997年b）
葡萄球菌蛋白G（蛋白G）280N项或C项直链淀粉/低pH值或直链淀粉Protein AG琼脂糖和试剂盒（Thermo Scientific）净化和增加溶解度蛋白质水解稳定；可能增加融合的溶解度；分泌融合蛋白；提纯不产生高产量；大的标签尺寸和/或低pH洗脱可能不可逆地影响蛋白质性质；矩阵的可重用性有限Nilsson等人（1997年b）
链状标签8–9（WSHPQFEK）或（AWAHPQPGG）N项或C项链球菌-塔克汀（改良链球菌抗生物素）/生物素或去硫生物素斯特雷普-标签®–斯特雷普-Tactin®系统（IBA GmbH）；Strep-tag®表达载体（神经组学）检测、纯化和固定简短的线性识别基序；矩阵可再生；用于厌氧条件下的纯化、真核细胞表面显示和固定到链球菌素涂层表面（例如SPR芯片）；特定的结合条件可能不适合某些融合斯凯拉和施密特（2000）
链霉亲和素159N项或C项生物素/生物素或变性（例如，加热、尿素）不适用检测、纯化、增加表达和固定可增加融合蛋白的蛋白水解稳定性以增加表达；对生物素具有极高的亲和力，可用于在SPR芯片等表面固定融合；大尺寸或四聚体的形成可能会破坏融合蛋白的特性；加入游离生物素后，融合蛋白可能不会释放，需要变性洗脱后再折叠；对用于纯化的生物素亲和力较低的新型链球菌抗生物素突变体Sano等人（1998年）
小泛素样修饰物（SUMO）100N项Ni-NTA、Ni-IMAC或色谱/SUMO蛋白酶Champion™pET SUMO表达系统（生命科技）；SUMOstar套件（生命传感器）；Expresso®SUMO克隆和表达系统（Lucigen）增加溶解度和表达允许进行细胞蛋白质相互作用研究；可用于细菌、酵母、昆虫和哺乳动物表达系统；去氨酰化酶和SUMO标签含有His6标签，可以有效去除；可用于蛋白质标记在体外以及体内
串联亲和纯化（TAP）变量N项或C项取决于TAP变体InterPlay哺乳动物TAP系统（安捷伦科技）；FLAG®HA系统（Sigma-Aldrich）净化两步纯化可获得非特异性背景降低的高纯度蛋白质；温和的洗脱条件不会影响融合特性；感兴趣的蛋白质保持天然形式；洗脱时不需要使用蛋白酶；可提供30多种TAP变体李（2011）
T7表位260N项单克隆抗体/低pH不适用纯化和增加表达可能增加融合蛋白的表达；不溶性蛋白质被靶向包涵体；有毒蛋白质的变性纯化需要重折叠史蒂文斯（2000）
硫氧还蛋白（Trx）109N项或C项氧化苯胂碱/含硫醇的还原剂（例如DTT、β-ME）ThioFusion系统（生命技术）溶解度增加热稳定性；可能增加融合蛋白的溶解度；细菌周质粗提物的简便纯化；在洗脱步骤之前，必须在没有硫醇还原剂的情况下进行净化；大标记或洗脱条件可能影响融合蛋白的性质Terpe（2003）
TrpE公司25–336N项或C项单克隆抗体/低pH不适用纯化和增加表达表达的较大结构体可能针对包涵体（允许高水平表达有毒基因）；抗体纯化不产生高产量；低pH洗脱可能不可逆地影响蛋白质性质；矩阵的可重用性有限；大标签可能影响融合蛋白的特性史蒂文斯（2000）
泛素76N项不适用不适用溶解度增加可能增加表达于大肠杆菌; 在真核细胞中不适用于表达史蒂文斯（2000）
通用6（HTTPHH）N项、C项或内部单克隆抗体/低pH不适用检测和净化序列HTTPHH的翻译与读帧无关，便于克隆；多标签拷贝增加抗体特异性；在SPR研究中，固定化单克隆抗体可以结合多个标签拷贝；抗体纯化不产生高产量；低pH洗脱可能不可逆地影响蛋白质性质；矩阵的可重用性有限Nelson等人（1999）
VSV-G型11（YTDIEMNRLGK）C术语单克隆抗体/低pHpVPack-VSV-G矢量（EMD Millipore）检测和净化VSV-G的C项残基；一步合成相对纯净的蛋白质；抗体纯化不产生高产量；低pH洗脱可能不可逆地影响蛋白质性质；矩阵的可重用性有限

LacZ，也称为β-半乳糖苷酶或β-gal，是一种蛋白质水解稳定的1024个氨基酸蛋白，可用作亲和标记，以增加融合蛋白的表达大肠杆菌(Sambrook等人，1989年). LacZ融合蛋白可以通过固定化的底物亲和层析纯化第页-氨基苯基-β-D-硫代半乳糖苷酶（APTG），并用高pH硼酸盐缓冲液洗脱。然后使用比色酶分析实现检测。LacZ在免疫学上相对中性，因此它是产生感兴趣蛋白抗体的有用融合伙伴。由于LacZ亲和标签的尺寸非常大，并且容易在溶液中形成同源四聚体，因此可以改变纯化融合蛋白的功能活性。此外，LacZ融合蛋白通常是不溶性的。这种不溶性有优点也有缺点：靶向包涵体的蛋白质可以表达对大肠杆菌，但因为LacZ必须正确折叠才能结合APTG，所以在纯化和/或检测之前必须对LacZ融合蛋白进行折叠(单元6.5).

常用亲昵标签

尽管蛋白A和lacZ今天仍被用作亲和标记（参见表9.9.1对于商用系统），最近开发了许多其他亲和标记，以改进这些原始蛋白融合伙伴。

聚组氨酸

多组氨酸亲和标记，也称为His-tag或His6，通常由六个连续的组氨酸残基组成，但长度可以从两个组氨酸残基变为十个。首次利用聚组氨酸通过固定化金属亲和色谱（IMAC）纯化重组半乳糖脱氢酶；单元9.4)1991年(Lilius等人，1991年). 以前，IMAC被用于纯化含有天然组氨酸或色氨酸序列的蛋白质，但这些序列通常不适用于亲和标记系统所需的蛋白质表达和纯化(Smith等人，1988年;Ljungquist等人，1989年).

多组氨酸是一种普遍存在的亲和标签，大多数提供表达载体或蛋白质表达和纯化试剂的公司都提供与该标签相关的产品（见表9.9.1例如）。组氨酸很容易与固定化的过渡金属离子形成配位键。固定化公司2+，铜2+，镍2+，锌2+，加利福尼亚州2+、和铁3+都可以用来纯化多组氨酸融合蛋白，但镍2+是最常用的。如果用镍净化2+这并不令人满意，可以通过经验测定最有效的过渡金属离子来纯化特定的多组氨酸融合蛋白。有几家公司提供IMAC树脂。IMAC最广泛使用的基质是Ni（II）-硝基三乙酸（Ni-NTA），可从奇亚根购买(沃，2005年). 用于固定过渡金属离子的其他树脂包括亚氨基二乙酸琼脂糖（螯合Sepharose，GE Healthcare）和羧甲基天门冬氨酸琼脂酶（Talon树脂，Clontech）。商用IMAC树脂不受蛋白酶或核酸酶活性的影响，适用于从粗细胞裂解液中纯化融合蛋白。这些树脂中的大多数可以再生并无限期地重复使用。虽然多组氨酸通常不会导致蛋白质被靶向大肠杆菌包涵体，IMAC易于使用变性剂（即8 M尿素、6 M胍·HCl、离子和非离子洗涤剂以及低浓度还原剂）来纯化不溶性或膜结合蛋白。高浓度的还原剂，如二硫苏糖醇（DTT）可以减少固定化金属离子，应避免使用。多组氨酸标签相对较小的尺寸和电荷很少影响蛋白质功能，而咪唑梯度洗脱相对温和，保留了多组氨酸融合蛋白的免疫原性。

虽然纯化高表达的多组氨酸融合蛋白可以在一个色谱步骤中得到相对纯净的蛋白质（>80%），但从昆虫和哺乳动物细胞中纯化的蛋白质中含有比其高百分比的His残基大肠杆菌，可导致与固定化金属离子的显著背景结合。这可以通过使用严格的洗涤条件（例如，5至10 mM咪唑）来避免，尽管严格的洗涤可能会导致相关蛋白质过早洗脱。标签的位置（N端、C端或内部）也可能对IMAC产生影响。如果标签位置的改变不能提高IMAC的有效性，可以尝试变性纯化。

还开发了检测多组氨酸融合蛋白的初级抗体在体外再次，由于组氨酸残基在哺乳动物和昆虫系统中占主导地位，抗多组氨酸抗体是臭名昭著的混杂性抗体。镍2+树脂还可用于沉淀多组氨酸标记的蛋白质，以检测蛋白质之间的相互作用。

谷胱甘肽S公司-转移酶

pGEX公司大肠杆菌表达载体，编码N-末端谷胱甘肽S公司-首先设计了转移酶（GST）分子和蛋白酶裂解位点，并用于表达和纯化寄生虫抗原羊带绦虫1988年(史密斯和约翰逊，1988;史密斯，2000). 目前，GE Healthcare可在所有三个阅读框中提供pGEX载体，并具有三个不同的蛋白酶裂解位点（例如凝血酶、因子Xa和PreScission）。GST融合蛋白可通过亲和层析纯化(单元6.6)市售谷胱甘肽（γ-谷氨酰半胱氨酸甘氨酸）Sepharose（Kd日=0.6 nM），受粗细胞裂解物中γ-谷氨酰转肽酶活性的影响。因此，谷胱甘肽树脂的使用寿命有限，只能再生和重复使用四到二十次。谷胱甘肽亲和层析适用于低浓度变性剂（2至3 M尿素或盐酸胍）、还原剂（<10 mM 2-巯基乙醇或二硫苏糖醇）和非离子洗涤剂（2%v/v吐温20），具体取决于融合蛋白的性质。GST融合蛋白与谷胱甘肽琼脂糖孵育，以促进两者之间的交联。用10 mM谷胱甘肽洗脱相对温和，通常保留蛋白质功能和抗原性。70千Da大肠杆菌热休克诱导的伴侣蛋白通常与洗脱的GST融合蛋白发生共渗(Thain等人，1996年). 用5 mM MgCl处理细胞裂解液可以去除这种污染物2提纯前5 mM ATP。此外，GST可以从其融合蛋白中分离出来，同时仍然与谷胱甘肽琼脂糖结合，为从感兴趣的蛋白质中分离26 kDa GST提供了一种方便的方法。

GST融合蛋白通常在大肠杆菌（典型产量约为10毫克/升），这可能导致包涵体中聚集的蛋白质积累。从包涵体中纯化(机组6.5)既有优点也有缺点。一些优点是蛋白质靶向大肠杆菌包涵体允许有毒基因的高水平表达，包涵体的分离是从全细胞裂解物中纯化的重要步骤。不幸的是，由于谷胱甘肽亲和层析依赖于GST的适当三维折叠，因此在纯化之前必须对不溶性融合蛋白进行折叠并交换缓冲液；然而，一些不溶性蛋白质可能无法正确地重新折叠或形成可溶性形式。GST标记的另一个潜在缺点是，标记的26kDa大尺寸及其在溶液中的二聚化可能会影响融合蛋白的性质。

GST融合蛋白可以用GST底物1-氯-2,4-二硝基苯（CDNB）或抗GST抗体（例如，GE Healthcare、Sigma、BD Biosciences）通过比色法检测。GST融合蛋白与谷胱甘肽偶联珠的沉淀通常用于检测蛋白质-蛋白质或蛋白质-DNA相互作用。

麦芽糖结合蛋白

pMAL公司大肠杆菌1988年设计了表达载体(di Guan等人，1988年;Maina等人，1988年). 麦芽糖结合蛋白（MBP）通常用于增加其融合伙伴的表达水平和/或溶解度，每升培养物的典型产量为10至40 mg融合蛋白。pMAL载体可用于所有三个阅读框中的细胞质或周质表达，具有因子Xa、肠激酶或基因酶I蛋白酶裂解序列（新英格兰生物实验室）。其他MBP融合载体包括pIVEX（Roche），可用于耦合在体外转录/翻译。

MBP融合蛋白可在交联直链淀粉树脂上通过亲和层析纯化。直链淀粉树脂可以在市场上买到，但受粗细胞裂解液中淀粉酶活性的影响，只能再生和重复使用三到五次。向细菌生长介质中添加葡萄糖有助于抑制淀粉酶表达（参见新英格兰生物实验室pMAL融合系统常见问题解答：http://www.circuit.neb.com/neb/faqs/faq_pfp.html). 直链淀粉亲和层析不适合变性剂或还原剂。根据融合蛋白的性质，可以使用低浓度的非离子洗涤剂（0.2%v/v Triton-X或Tween 20）。

与GST融合蛋白一样，MBP融合蛋白在大肠杆菌可能导致包涵体中不溶性蛋白质聚集体的积累。MBP标签的大尺寸（45kDa）也可能影响蛋白质功能。不像谷胱甘肽亲和层析(单元6.6)tag与直链淀粉树脂结合时的蛋白水解裂解是无效的，在裂解前必须用游离麦芽糖洗脱融合蛋白。10 mM麦芽糖洗脱足够温和，通常可以保持蛋白质功能和抗原性。如果对MBP标签进行蛋白水解去除，如果MBP要重新结合直链淀粉柱，则必须通过额外的色谱步骤从裂解的MBP中去除游离麦芽糖（NEB建议使用标准DEAE色谱法）。可使用抗-MBP抗体检测MBP融合蛋白（例如BD Biosciences、Sigma、Zymed）。

钙调素结合肽

钙调素结合肽（CBP）纯化系统利用肌肉肌球蛋白轻链激酶的C末端片段来纯化细菌感兴趣的蛋白质。在生理pH值下，这26个氨基酸片段具有很强的亲和力（Kd日= 10−9M） 蛋白质钙调素(Simcox等人，1995年). 钙的去除导致钙调素发生构象变化，导致配体释放。已经对基于T7的pET表达载体进行了工程设计，以允许CBP亲和标签附着到融合蛋白的C-末端或N-末端。

该系统的优点包括其温和的结合和洗脱条件，这有助于提高融合蛋白在纯化后保持其天然形式的能力。粗细胞裂解物通过钙调素亲和树脂一次就足够了，随后在中性pH下用2 mM EGTA洗脱感兴趣的蛋白质(http://www.stratagene.com/manuals/214407.PDF). CBP标签本身的4kDa大小相对较小，不太可能影响相关蛋白的属性，因此与较大的标签相比，这是一个吸引人的亲和标签。

Intein-甲壳素结合域

内含子-几丁质结合域（intein-CBD）标签是蛋白质自剪接元件（intein）与几丁质绑定域的组合，可以在不需要蛋白酶的情况下纯化天然重组蛋白。Intein-CBD公司大肠杆菌表达载体设计于1997年(Chong等人，1997年). 商用载体可在感兴趣的异源蛋白的N末端、C末端或两个末端上提供内含物-CBD表达（IMPACT系统，新英格兰生物实验室）。

在几丁质树脂上通过亲和层析纯化CBD融合蛋白。商用树脂可以再生至少五次。通过严格清洗，包括高盐或洗涤剂（2 M NaCl，0.5%Triton X），可以减少甲壳素树脂的非特异性结合。甲壳素亲和色谱法不适用于尿素或盐酸胍等变性试剂。提纯期间可以使用低浓度的还原剂（<1 mM二硫苏糖醇或<5 mM 2-巯基乙醇），但较高浓度会过早激活内含子自裂解反应。根据融合蛋白的性质，也可以使用低浓度的非离子洗涤剂（即0.2%Triton-X或Tween 20）。

在4°C下用50 mM DTT隔夜孵育诱导内含子自分裂反应。也可以使用2-巯基乙醇、半胱氨酸或羟胺，但效果较差(Chong等人，1997年)后两者与裂解蛋白形成永久复合物。具有N端半胱氨酸和/或C端硫酯的蛋白质的产生可用于蛋白质标记、连接或环化(Chong等人，1997年). 内含子CBD表达和纯化的典型产量为每升细菌培养物约0.5至5毫克裂解蛋白。

链霉亲和素/生物素标签

体内含有生物素化信号肽（BCCP）的异源蛋白质的生物素化于1990年首次报道（Cronan，1990）。生物素连接酶负责通过辅酶的羧基和蛋白质上的赖氨酸残基之间的酰胺键将生物素连接到感兴趣的含BCCP的蛋白质上。Promega提供的PinPoint Xa载体提供了所有三个阅读框和一个因子Xa裂解位点。PinPoint表达和纯化系统的典型产量为每升细菌培养物1至5 mg融合蛋白。

生物素化蛋白可以通过亲和层析在亲和素树脂上纯化，尽管传统亲和素或四聚体亲和素吸附树脂的亲和常数为Kd日= 10−15M，因此需要强烈的变性洗脱（例如，加热、尿素或盐酸胍）。商用单体亲和素树脂的亲和常数为Kd日= 10−7M（即SoftLink亲和素树脂，Promega），可以再生至少十次，并允许用温和的10 mM生物素缓冲液洗脱生物素化融合蛋白。变性试剂与亲和层析不兼容。根据融合蛋白的性质，可以使用低浓度还原剂或非离子洗涤剂。

几乎没有与亲和素的非特异性结合大肠杆菌系统。本机BCCP不绑定到avidin；然而，哺乳动物系统中至少有四种生物素化蛋白物种可以与感兴趣的生物素化蛋白质共同洗脱(Hollingshead等人，1997年). 生物素化蛋白可通过碱性磷酸酶（AP）或辣根过氧化物酶（HRP）偶联链霉亲和素、生物素初级抗体或荧光或放射性生物素标记来检测。用链霉亲和素偶联珠测定生物素沉淀(单元9.7)可用于检测蛋白质或蛋白质-DNA相互作用。此外，生物素和链霉亲和素（Kd日≅ 10−15M） 使生物素标签有助于将融合蛋白固定在链霉亲和素涂层表面，例如表面等离子共振芯片（Sensor Chip SA，Biacore）。

除了体内生物素化的BCCP标签、其他纯化系统利用生物素与链亲和素或抗生物素之间的高亲和力相互作用。链亲和素结合肽（SBP）长度为38个残基，可用于将融合蛋白固定在链亲和蛋白基质上。此外，链标记和链II-Tag（Sigma）是8到9个残基的肽，可结合突变形式的链亲和肽。Strep-Tag被鉴定为一种8氨基酸肽，与D-生物素可逆地结合在同一口袋中。多年来，肽（Strep-Tag和Strep-II-Tag）和链霉亲和素核心（Strep-Tactin）都被设计为具有最佳结合亲和力。使用Strep II-Tag的一个特别优点是它不会干扰蛋白质折叠或分泌，因此非常适合研究功能蛋白质。许多商用表达载体可以将Strep II-tag融合到感兴趣的蛋白质的C-或N-末端，以便在细菌、哺乳动物和昆虫细胞中表达。Strep II-Tag对细胞蛋白酶具有耐药性，但克隆载体中可以包含蛋白酶识别位点。它可以通过用去硫生物素（一种D-生物素衍生物）洗涤而释放。在用HABA（2-[4′-羟基-苯偶氮]苯甲酸）洗涤后，该柱可再使用3-5次，该HABA可去除Strep-Tactin中的去硫生物素。

由于生物素对链霉亲和素的亲和力高于上述任何一种链霉菌亲和素结合肽的亲和力，因此链霉亲和力结合的SBP标记或链霉标记的融合蛋白可以被游离生物素有效洗脱。链霉亲和素本身也可用作亲和标记，用于纯化或固定生物素化基质上的融合蛋白。

His-Patch ThioFusion

硫氧还蛋白能够在大肠杆菌此外，硫氧还蛋白部分在某些情况下可溶解于以前不溶的异源蛋白质大肠杆菌不幸的是，用于提纯硫氧还蛋白融合蛋白的苯胂氧化物基质不能提供高产、高纯度的产品(Terpe，2003年). 为了解决这个问题，Life Technologies开发了一种具有组氨酸簇的突变硫氧还蛋白分子，当硫氧还毒素分子正确折叠时，组氨酸形成一个适合IMAC（His-patch ThioFusion表达系统；见Polyhistidine）的补丁。此外，标签可被因子Xa裂解，从而使融合蛋白与His-Patch ThioFusion分子分离，该分子长度大于100个残基，并且容易在溶液中二聚。虽然该表达系统的成本（>900.00美元）可能会阻碍其作为一线亲和标记的使用，但当其他生产大量可溶性蛋白的尝试失败时，His-Patch ThioFusion标记可能会有用。

串联亲和纯化

串联亲和纯化（TAP）是一种基于将两个亲和标签融合到感兴趣的蛋白质的双亲和纯化方法。TAP不仅可以纯化标记的蛋白质，还可以分离与感兴趣的蛋白质相互作用的蛋白质复合物。TAP标签本身由两个不同的亲和标签组成，每个亲和标签都是为了在两个连续步骤中分离感兴趣的蛋白质及其相互作用的蛋白质(李，2011). 这种方法的主要优点是，由于两个纯化步骤，非特异性背景降低。

TAP最初在酵母中使用21-kDa标签进行，该标签由由TEV蛋白酶裂解位点分离的ProtA（金黄色葡萄球菌蛋白a）和CBP（钙调蛋白结合肽）组成。此标签可以应用于C-或N-端子。虽然用这种方法可以获得20-30%的感兴趣的蛋白质，但TAP在高等真核生物中并不起作用。此外，如此大的标签（21kDa）可以干扰蛋白质功能，CBP可以干扰钙信号。尽管最初的ProtA/CBP标签仍然是使用最广泛的，但这些缺点导致创建了30多个TAP变体。

表位标记

相对较短的表位标签，如FLAG、血凝素（HA）、c-myc、T7和Glu-Glu等(表9.9.1)，用于检测融合蛋白在体外在细胞培养中。它们的短的线性识别基序很少影响感兴趣的异源蛋白的特性，通常对各自的一级抗体非常特异。一个例外是抗myc抗体，它有点混杂；然而，使用酶联二级抗体检测结合的抗myc一级抗体，而不是单独使用HRP或AP-抗myc结合物，可以提高特异性。

虽然抗体亲和层析通常需要低或高pH洗脱，这可能会不可逆地影响融合蛋白的性质，并且使用的树脂重复使用性有限，但可以使用表位标签的固定化初级抗体纯化表位标记蛋白。因此，当主要目标是高水平表达和融合蛋白纯化时，表位标签不是第一选择。

报告器标签

酶如β-半乳糖苷酶（β-gal）、碱性磷酸酶（AP）、氯霉素乙酰转移酶（CAT）和辣根过氧化物酶（HRP）是蛋白质表达和蛋白质相互作用的方便报告者。这些报告标签有时可用于蛋白质纯化，但经常用作检测蛋白质表达的报告标签。

β-半乳糖苷酶

β-gal与底物5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-d-吡喃半乳糖苷（X-gal）相互作用，生成蓝色沉淀。lacZ作为蛋白质纯化标签的优点和缺点已在上文中讨论过（参见早期亲和标签）。

碱性磷酸酶

AP与5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸/硝基蓝四唑（BCIP/NBT）相互作用，生成紫色沉淀。AP通常与一级抗体融合用于免疫印迹，但也可以与任何数量的非免疫蛋白融合用于远免疫印迹（即通过与另一蛋白的相互作用检测膜转移蛋白；单元19.7). 细菌表达载体可用于过度表达和纯化相关的AP标记蛋白（基因治疗系统）。由于AP通常针对大肠杆菌周质间隙，粗AP融合蛋白裂解物可通过周质提取纯化(单元5.2). AP融合蛋白可通过免疫亲和层析进一步纯化。

氯霉素乙酰转移酶

CAT活性测定的简便性和敏感性使CAT成为第一批用于哺乳动物基因表达研究的报告基因之一(Podbielski等人，1992年). 真核生物中未发现CAT基因，因此真核细胞不含背景CAT活性，可以使用放射性同位素标记或荧光标记底物乙酰辅酶A或氯霉素来检测。CAT融合蛋白可在固定化氯霉素（即氯霉素己酸琼脂糖，Sigma）上通过亲和层析纯化，并用游离氯霉素洗脱。

辣根过氧化物酶

辣根过氧化物酶（HRP）是一种44kDa蛋白质，对许多小分子底物的氧化进行催化，产生可通过分光光度法检测的有色或发光产物。HRP可以与一级或二级抗体甚至其他蛋白标签偶联，常用于蛋白质印迹、ELISA分析和免疫组织化学。

HRP产生有色产物的一些最常见底物是3,3-二氨基联苯胺（DAB）、3,3,5,5-四甲基联苯胺（TMB）和2.2′-叠氮二[3-乙基苯并噻唑啉磺酸盐（ABTS）当达到所需的变色程度时，可以通过添加酸来停止HRP催化的反应。ELISA和免疫组织化学协议中经常使用比色底物。

增强化学发光底物（ECL）是蛋白质免疫印迹检测中最常用的底物。当使用HRP标记的一级或二级抗体时，可以通过胶片或CCD相机产生的光检测到与膜结合的抗体。使用二级抗体可提高特异性并降低背景信号。据我们所知，目前还没有一种商业上可用的质粒，用于用HRP标记感兴趣的蛋白质以进行直接检测。

发展亲情标签技术

一些较新的亲和性标签尚未经过严格评估，因此不能推荐高于上述久经考验的亲和性标签（见常用亲和性标签）。尽管如此，许多新的亲和标记包含独特的属性，这可能使它们在麻烦的纯化中非常有用。

小泛素样修饰语

小泛素样修饰物（SUMO）家族蛋白长度约为100个氨基酸，在真核生物中高度保守。它们对正常细胞功能如核转运、信号转导和蛋白质稳定至关重要。SUMO蛋白通过与目标蛋白形成共价键发挥作用，通常在赖氨酸残基处，赖氨酸残留物随后被SUMO蛋白酶裂解。SUMO蛋白酶识别序列x-Gly-Gly-x，因此不裂解目标蛋白。SUMO蛋白酶的这一方面使SUMO成为一个有吸引力的亲和标记，因为不需要构建重组连接子区域，并且目标蛋白的天然N末端保持不变。SUMO的其他优点是它增加了蛋白质的表达和溶解度。有几种商用试剂盒可利用酵母和人类SUMO蛋白质和蛋白酶（生命技术和生命传感器）。由于SUMO在原核生物中不表达，大多数试剂盒使用大肠杆菌表达蛋白质，通常包括多组氨酸标签。SUMO被裂解后，可以使用多组氨酸抗体、Ni-NTA或Ni-IMAC或色谱分离蛋白质。SUMOstar试剂盒可用于昆虫和哺乳动物细胞中SUMO标记蛋白的表达和纯化。

HaloTag®（卤代标签）

HaloTag®（Promega）是一种33-kDa蛋白质，基于细菌中发现的改良卤代烷脱卤酶。在细菌中，天然脱卤酶通过亲核置换反应去除脂肪烃中的卤化物(Los等人，2008年). Asp106负责形成酶底物复合物，His272负责水解中间体。点突变His272Phe破坏水解，导致酶和底物之间的共价键。市面上可买到的HaloTag®具有His272Phe点突变以及导致配体结合增加的其他氨基酸替换。

虽然其他水解酶可以被修饰，但卤代烷脱卤酶有几个优点：它是一种小蛋白，不需要使用辅因子或翻译后修饰来进行酶反应。此外，卤代烷脱卤酶的配体可以设计成通过细胞膜扩散，无毒，并避免与其他细胞蛋白发生交叉反应。(Los等人，2008年). 对于蛋白质纯化，将表达载体转染到细胞系中以产生融合蛋白。然后将合成HaloTag®配体添加到细胞中以标记蛋白质。合成配体可以具有许多功能基团中的一个，包括各种表位标签（例如GST）。这种多功能性使HaloTag®不仅可用于在体外蛋白质标记和纯化体内标记。然后将细胞溶解，并将融合蛋白捕获在纯化基质上。突变的氢化酶HaloTag®通过固定化氯烷烃与HaloLink®树脂共价连接。这种共价键使得基质的洗涤条件更加苛刻。洗涤后，使用TEV蛋白酶将感兴趣的蛋白质从HaloTag中分离出来。HisLink®树脂用于从蛋白质中去除TEV蛋白酶，得到高纯度、无标记的蛋白质。

Profinity eXact软件

Profinity eXact™系统（Bio-Read）基于来自解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌素是枯草酶蛋白家族的一员，在底物选择上有点混乱。枯草杆菌素的作用是结合其底物的残基P1-P4，从而在枯草杆菌肽的β链100–104和125–129之间插入底物的主干（Biao等人，2004年）。枯草杆菌素工程产生了一种具有重组P1和P4结合囊的突变枯草杆菌蛋白，以提高序列选择性。枯草杆菌素的生物合成依赖于75氨基酸N末端前体(Ruan等人，2004年). 正是这个序列被修改成了标签。使用表达载体创建重组蛋白，该重组蛋白包含感兴趣蛋白N末端的枯草杆菌素前体标记。然后将重组蛋白应用于带有固定化枯草杆菌蛋白酶的柱中。成熟枯草杆菌蛋白酶在标签C末端的裂解由氟化物缓冲液启动，允许纯化的目标蛋白释放。结果是一种具有天然N末端的无标记蛋白质。

Profinity eXact™系统的主要优点包括不需要使用任何蛋白酶。它允许在一个步骤中快速进行30分钟的柱上纯化和切割，使纯化的蛋白质保持其天然结构。此外，柱可以通过在pH＝2.1时去除结合的前结构域来再生（Biao等人，2004）。众所周知，枯草杆菌素前体标记与可溶性异源三聚体G蛋白α亚基作用良好，当试图纯化或过度表达时，这些亚基往往会出现问题。标签本身的疏水部分增加了融合G蛋白的溶解度，并且已经证明，在使用Profinity eXact™系统的纯化过程中，不会改变结构或激活动力学(Abdulaev等人，2005年).

基于PDZ域的标记

突触后密度蛋白(P（P）SD95），果蝇盘大肿瘤抑制因子(D类lg1）和小带闭塞蛋白-1(z（z）o-1）是首批发现的共享PDZ结构域的三种蛋白质，PDZ结构区是一个小的（约10kDa）结构域，在物种间很常见。PDZ结构域与蛋白质靶点的C末端结合，通常存在于信号转导途径中，它们将不同的信号成分支架在一起。果蝇蛋白InaD的N末端PDZ结构域（PDZ1）被认为是一个潜在的蛋白质标记系统，因为它通过分子间二硫键与目标NorpA的C末端结合。带有NorpA标签的蛋白质可以通过二硫键的还原从PDZ偶联树脂中洗脱出来（反之亦然）(Kimple等人，2001年;Kimple和Sondek 2002).

PDZ/C末端肽相互作用最近被用于其他应用。正在开发一种利用E6 PDZ与其C末端靶标（Arbor Vita）之间的结合亲和力的人类乳头状瘤病毒（HPV）E6蛋白试纸测试。与InaD/NorpA相互作用一样，该技术也有可能用于标记和检测异源蛋白。

亲合力标签和蛋白质纯化

图9.9.1,9.9.2、和9.9.3根据三种不同的理想蛋白质纯化结果给出选择亲和标记的一般方案：大量高纯度、未标记的蛋白质(图9.9.1)，中等量的高纯度标记或未标记蛋白质(图9.9.2)以及少量中纯度到高纯度的标记蛋白(图9.9.3). 这些流程图应作为初始指南，但更困难的蛋白质纯化问题可能需要使用不同于推荐系统的系统。

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流程图描述了在需要大量（10–100 mg）高纯度未标记蛋白质的情况下，选择亲和标签进行蛋白质纯化的一般方案。需要这种高纯度天然蛋白质的实验方法包括但不限于蛋白质结晶学、核磁共振波谱、等温滴定量热法和表面等离子体共振。实线表示纯化优化的正向进展，虚线表示反向步骤，厚框表示最终所需产品，即高纯度和高质量的蛋白质。

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如果需要中等量（0.1–10 mg）的高纯度标记和/或未标记蛋白质，则描述选择亲和标签进行蛋白质纯化的一般方案的流程图。需要这种量的标记蛋白质的实验方法的一个例子是表面等离子体共振（SPR），其中生物素部分可以用来将蛋白质配体连接到链亲和素包被的SPR芯片上。其他可能的应用包括GST和Ni2+沉淀分析和质谱分析。内膜-CBD结构域的某些变体对于需要完全天然蛋白质的方法很有用。最后，His-tag和GST-tag系统很有用，因为标记和未标记的蛋白质都可以很容易地从相同的细胞裂解液中制备，并且有许多二级试剂专门用于这两个系统。粗线表示已达到所需结果。

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流程图描述了选择亲和标记以纯化少量（<0.1 mg）中纯度至高纯度标记蛋白质的一般方案。这种蛋白质可用于联合免疫沉淀、蛋白质印迹、远Western印迹、ELISA或凝胶覆盖分析。由于只需要少量的蛋白质，因此通常不需要优化蛋白质表达，亲和标记的选择取决于融合标记的最终用途，例如作为报告者或用于一般检测。表位标签的示例包括HA-tag、FLAG-tag、T7-tag、Myc-tag等。

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