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二级抗体针对一级抗体的同种型提出,并用于通过在一个以上的地方与一级抗体结合来检测一级抗体。这导致一些二级抗体与一级抗体结合,每个二级抗体都有多个标签,例如Alexa Fluor公司®,人力资源计划,应用程序,生物素、和金结合二级抗体.
许多因素可能会影响次级抗体的特异性、敏感性和一致性。以下是一些需要考虑的事项:
二级抗体是针对产生一级抗体的宿主物种而产生的,例如,如果您使用在兔子体内培养的一级抗体,则需要在兔子以外的宿主物种中培养的抗兔子二级抗体(例如驴抗兔子二次抗体)。
二级抗体往往以共轭形式出现。可以与酶、生物素和荧光染料/蛋白质。
结合物的选择取决于实验应用,并允许在细胞成像、免疫组织化学、流式细胞术和western印迹中对一级抗体进行比色、荧光或化学发光检测。
对于诸如ELISA或蛋白质印迹的应用,酶联二级体通常是最受欢迎的,而对于流式细胞术或免疫荧光来说,更喜欢与荧光蛋白或染料结合的二级抗体,例如Alexa Fluor公司®.
下表显示了不同共轭二级抗体的最常用应用:
免疫细胞化学,IHC-Fr
Alexa Fluor公司®, DyLight®(DyLight®;)
免疫组织化学
生物素,HRP或 HRP聚合物
二级抗体必须针对一级抗体的同型。多克隆初代通常在兔子、山羊、绵羊或驴中饲养,并且通常是IgG等型。因此,二级抗体通常是抗IgG H&L(重链和轻链)抗体。
单克隆一级抗体在小鼠、兔和大鼠中常见;如果主要单克隆抗体是小鼠IgG1,则需要抗小鼠IgG或特异性较低的F(ab)片段抗小鼠Ig G。
多克隆结合多个表位,导致更高的敏感性,尽管这有时意味着更少的特异性。单克隆检测单个表位并产生高度特异性抗体。
我们还提供重组多克隆抗体,它是多克隆的有力替代品。它们是精心选择的个体重组单克隆抗体的明确混合物,旨在识别同一抗原上的不同表位,提供与重组单克隆抗体相同的特异性和再现性。
前吸附二级抗体
前吸附二级抗体 当同时使用多个一级抗体及其相应的二级抗体时,是多色实验的理想选择。预吸附过程降低了细胞和组织样本上二级抗体和内源性免疫球蛋白之间交叉反应的风险。
F(ab)或(Fab')2片段二级抗体
F(ab)和(Fab')2片段抗体消除抗体的Fc部分与细胞(如巨噬细胞、树突状细胞、中性粒细胞、NK细胞和B细胞)上的Fc受体之间的非特异性结合,并因其体积较小而更有效地穿透组织。
由于片段抗体没有Fc部分,因此它们不会干扰抗Fc介导的抗体检测。
生物素化二级抗体
生物素与亲和素或链霉亲和素形成大的复合物,用于信号放大。无论是用亲和素-生物素复合物(ABC)方法还是用生物素化二级抗体标记的链亲和素生物素(LSAB)方法,都可以在免疫组织化学(IHC)或ELISA中放大信号。由于多个生物素分子与二级抗体结合,生物素化二级抗体可以轻松检测低水平表达的蛋白质。了解更多有关生物素化二级抗体的信息。有关如何为您的实验选择正确的二级抗体的更多信息,请查看我们的二级抗体选择指南。
荧光标记二级抗体
荧光偶联物优先用于细胞成像、流式细胞术和免疫组织化学冷冻样品(IHC-Fr)。由于能够与一级抗体结合并且能够通过显微镜检测到的共轭二级抗体的数量增加,它们允许对细胞和组织中的一级抗体进行信号放大检测。
酶
酶标签通过显色反应可视化,其中可溶性无色底物转化为水不溶性有色化合物。常用的酶包括辣根过氧化物酶(HRP)(主要用于IHC)和碱性磷酸酶(AP)(主要用来western blot)。
吸收/发射光谱和消光系数
请参阅下面的荧光共轭物吸收/发射光谱和消光系数,以规划您的多色面板,或单击此处查看我们的荧光图,以帮助您选择最合适的荧光:
标签
最大吸收(nm)
最大发射(nm)
Alexa Fluor®405
402
421
Cy2型
489
506
Alexa Fluor®488型
495
519
FITC公司
494
520
Alexa Fluor®555
555
565
Cy3(Cy3)
550
570
藻红蛋白
488
575
罗丹明
544
576
周期3.5
589
Alexa Fluor®568公司
578
603
PE/德州红®
535
615
德克萨斯红®
595
Alexa Fluor®594公司
590
617
空气污染指数
650
662
Cy5细胞
643
667
Alexa Fluor®647型
668
PE/Cy7
670
Cy5.5周期
675
694
PE/Cy5.5
Alexa Fluor®680
679
702
Alexa Fluor®750
749
775
APC/Cy7
633
776
Alexa Fluor®790
784
814
有关如何为您的实验选择合适的二级抗体的更多信息,请参阅我们的二次抗体选择指南: