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改进流式细胞术结果。
更新时间:2023年7月24日。
下载完整的流式细胞仪指南
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每个流式细胞术分析都从适当的控制开始,以确保数据的可靠性和准确性(图1)。
什么时候?设置流式细胞术实验时,请确保包含以下适当的控件:
图1。流式细胞术所需的一些对照。
死细胞会因自身荧光和增加非特异性结合而产生假阳性。这就是为什么我们必须从数据分析中消除这些死细胞。
流式细胞术中可以使用几种类型的细胞活性标记来区分死细胞和活细胞,包括细胞DNA、细胞酯酶和细胞伯胺(表1)。
表1。细胞活性标记物的类型和相应的染料。
DNA结合染料用于分析活细胞而不固定。
这些染料无法穿透活细胞的完整细胞膜。死细胞的细胞膜受损,这些染料可以进入细胞核。这些染料与双链DNA的结合导致其荧光显著增强,有助于活细胞与死细胞的分化。
由于缺乏代谢活性酯酶和完整的细胞膜,这些染料不会对死细胞染色,并且在分析活细胞时使用,通常不固定。
进入细胞后,染料在细胞内酯酶的促进下水解后变成荧光。这些改性染料被捕获在细胞膜完整的细胞中。在某些情况下,水解染料进一步与其他细胞内成分反应,形成不可逆标记。
胺类活性染料与细胞中的游离伯胺反应。由于这些染料无法穿透细胞膜,因此它们不会污染活细胞的胞内胺,导致死细胞的荧光强度比活细胞显著增加。
这些染料与胺的不可逆反应使它们与染色后的细胞固定和渗透相兼容,因此与细胞内染色方案.
自体荧光受细胞类型和生理条件的影响。天然存在的细胞成分,如NADPH和黄素,可以在488 nm波长的激光激发下发出荧光。
为了检查自体荧光在实验中是否存在问题,请使用与实验样品相同的细胞处理和机器设置,在流式细胞仪上分析等分的未染色细胞。如果有明显的自荧光,使用不同的激光波长可以解决这个问题。请参阅我们的荧光图或多色选择器 探索使用您选择的染料的替代激光器。
执行多色流式细胞术实验,各种荧光团的发射光谱可能重叠,导致在不同的通道中检测(也称为溢出)。
当正边界或负边界不明确时,此现象可能导致误报或错误选通。然而,这可以通过补偿来控制,其中估计光谱重叠,并从总检测信号中减去光谱重叠,以得出每种染料实际含量的估计值,或者包括荧光减一(FMO)控制,以定义阳性/阴性总体。
FMO对照品是除一种抗体外,在一个小组中用所有抗体染色的样品,对于提供给定通道中溢出的测量以及准确区分阳性和阴性细胞群至关重要1。此控件提供真正的负控制,因为它考虑面板中的其他荧光团如何影响在用于检查荧光团的通道中观察到的信号。例如,在FITC、PE-Cy5、PE-Cy 7和PE的多色面板中,PE FMO控件将包含FITC、Cy-PE和Cy7-PE试剂,但不包含PE(图2)。
图2。FMO控件示例。如果使用未染色控件设置PE阳性/阴性单元格的选通(下线,未染色选通),则右侧点图中该行上方的所有单元格都将显示为PE阳性。然而,当使用FMO控件设置选通(上线,FMO选通)时,很明显存在信号扩散,一些细胞PE不阳性。图a改编自Perfetto,S.P.等人,2004年。
这个宽泛的术语包括抗体结合的每一个实例,这些实例阻止了对数据的正确解释。优化染色方案并进行适当的阴性对照有助于检测和缓解这些影响。
优化多色流式细胞仪染色方案
抗体是流式细胞术技术的关键组成部分,但许多抗体的特异性、缺乏交叉反应性或在流式细胞仪中的应用尚未得到验证2. 为了确保数据的可复制性和可靠性验证你的抗体通过至少一种方法或从可信赖的供应商处购买经验证的抗体。
许多abcam的流式细胞术抗体用敲除细胞系金标准技术进行基因验证,提供您可以信赖的结果。
非最佳抗体浓度会增加非特异性结合或降低测量的灵敏度。因此,应对所有抗体进行滴定,以确定最佳信噪比(图3)。
图3。滴定抗体以提高流式细胞术的灵敏度。
吞噬细胞,如单核细胞,其表面有Fc受体(FcRs),可以与抗体的Fc区非特异性结合,染色前添加FcR阻断试剂可以阻断这种结合(图4)。该阻断步骤应包括在均质组织样品中,其中可能含有巨噬细胞,以及Daudi和THP-1等细胞培养系。
图4。Fc阻断减少流式细胞术中的非特异性抗体结合。
阴性对照应为不表达感兴趣抗原的细胞群,理想情况下为敲除细胞系。该样本应暴露在与研究人群相同的实验条件下。使用此控件设置选通区域并区分阳性和阴性单元格。
阳性对照是已知的表达你感兴趣目标的细胞。这种控制使我们能够避免错误抗体导致的假阴性。然而,阳性对照细胞可能并不总是可用的。
同位素控制是针对被分析细胞类型上或中不存在的抗原而产生的抗体。同位素对照决定非特异性抗体结合引起的背景荧光水平。它们不应用于区分阳性细胞和阴性细胞或设置阳性门控区。
理想的同型对照应:
请参阅我们完整的同种控制指南了解更多信息。
当使用二级抗体时,这种类型的控制至关重要,因为它将允许我们评估与二级抗体相关的非特异性结合的程度。为了建立二级抗体控制,我们可以使用只使用二级抗体处理过且未接触过一级抗体的细胞。
等克隆对照显示荧光团或其他抗体缀合物是否与细胞成分非特异性结合。
在存在过量相同(等克隆)未标记抗体的情况下,用结合抗体对细胞进行染色。样品中的特定抗体结合位点被未结合抗体占据,而结合抗体只能通过结合物结合。
缺乏荧光信号表明,共轭物与样品中的任何成分都没有非特定的结合。与任何同型控制一样,这种控制仅是定性的。
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