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审查日期:2020年12月14日
Western blotting是一种使用 特异性抗体 鉴定通过凝胶电泳根据大小分离的蛋白质。免疫分析使用由硝化纤维素或PVDF(聚偏氟乙烯)制成的膜。凝胶被放置在膜的旁边,电流的作用诱导蛋白质从凝胶迁移到膜。然后,可以使用针对感兴趣目标的特定抗体对膜进行进一步处理,并使用次级抗体和检测试剂进行可视化。
查看下面的western blot协议视频。
对于其他视频协议,请访问我们的视频协议库在这里.
>>打印完整的western blot协议
>>查看我们的western blot协议图
如果你想提高你在蛋白质印迹分析方面的技能,请查看我们的免费点播western blot培训.
这些缓冲液可以在4°C下储存数周,也可以等分并在-20°C下储存长达一年。
检查pH值并调整至6.8
检查pH值并调整至8.3
对于大于80kDa的蛋白质,我们建议SDS的最终浓度为0.1%。
3-5%牛奶或BSA(牛血清白蛋白)
添加到TBST缓冲区。充分混合并过滤。过滤失败会导致斑点,在颜色形成过程中,微小的深色颗粒会污染斑点。
–14000–17000克
T型时间和电压可能需要优化。我们建议遵循制造商的说明。除非抗体数据表中建议使用非还原性条件,否则应使用还原性凝胶。
所需的凝胶百分比取决于您感兴趣的蛋白质的大小:
蛋白质大小
凝胶百分比
4–40 kDa
20%
12–45千Da
15%
10–70 kDa
12.5%
15–100 kDa
10%
25–100 kDa
8%
也可以使用梯度凝胶。
膜可以是硝化纤维素或PVDF。用甲醇活化PVDF 1分钟,并在准备堆叠前用转移缓冲液冲洗。传输时间和电压可能需要一些优化。我们建议遵循制造商的说明。在阻断步骤之前,可以使用Ponceau S染色检查蛋白质向膜的转移。
按以下步骤准备烟囱:
图1。准备好的烟囱示例。
所有通道:β-肌动蛋白抗体负荷控制(ab8227),稀释度为1/5000
第一道:HeLa全细胞提取物通道2:酵母细胞提取物泳道3:小鼠脑组织裂解物
协议由Abcam“AS-IS”根据Abcam实验室使用Abcam试剂和产品的实验提供;在这些条件之外使用协议的结果可能会有所不同。
蛋白质印迹的目的是根据分子量分离凝胶上的蛋白质。然后将蛋白质转移到膜上,在膜上可以使用抗体进行检测。在含有还原剂(如β-巯基乙醇)的样品缓冲液中,将样品和95℃加热5至10分钟。这导致线性化的蛋白质带有与其大小成比例的负电荷。
将凝胶放入电泳槽中并加入缓冲液,确保微孔顶部被覆盖。所用凝胶的丙烯酰胺百分比取决于目标蛋白质的分子量。将分子量市场加载到第一条通道中,然后将样品加载到相邻的井中。所有样品都含有等量的蛋白质。装载完所有样品后,添加流动缓冲液,将盖子放在电泳槽上。打开电源并设置凝胶罐中凝胶制造商建议的电压。你应该能看到气泡从油箱里冒出来。运行凝胶,直到染料前沿充分向下移动凝胶。
下一步是将蛋白质从凝胶转移到膜上。膜通常由硝化纤维素或PVDF制成。从罐中取出凝胶,小心地将其从塑料盒中取出。切断微孔和凝胶脚,将凝胶放入转移缓冲液中。通过在滤纸和海绵之间夹住薄膜和凝胶来准备转移堆栈。膜应最靠近正极,凝胶应最靠近负极。使用小滚筒去除凝胶和膜之间的任何气泡。将分动箱夹紧,并将其浸入含有分动箱缓冲器的分动箱中。向外室加水以保持系统冷却,然后盖上盖子。打开电源以开始蛋白质转移。时间和电压需要优化,因此请查看制造商的说明以获取指导。
既然蛋白质已经从凝胶迁移到硝化纤维素膜上,那么可以用抗体检测到感兴趣的蛋白质。膜可以从盒中取出,分子量标记现在应该是可见的。如果需要,可以通过用胭脂红S溶液染色膜来确认蛋白质的转移。为了防止抗体的非特异性结合,需要封闭膜。将阻塞缓冲液倒在膜上,在摇杆上轻轻搅拌。通常,这是使用5%牛奶或牛血清白蛋白(BSA)的溶液在室温下两小时或在四度下过夜来完成的。应优化阻断缓冲液的时间和类型,因此请查看您打算使用的主要抗体的数据表以了解详细信息。
膜被封闭后,取出封闭缓冲液,将稀释的一级抗体加入同一溶液中。像以前一样在摇杆上孵化。通常,一级抗体孵育在室温下进行一小时,或在四摄氏度下过夜。抗体浓度和孵育时间需要优化。有关指南,请参阅抗体数据表。倒出初级抗体,并在洗涤缓冲液中冲洗膜两次。然后在摇杆上进行一次15分钟的清洗和三次10分钟的清洗。洗涤缓冲液通常为三缓冲盐水(TBS)或磷酸盐缓冲盐水(PBS),含0.1%吐温20。
倒出洗涤缓冲液,将膜培养在结合二级抗体中,二级抗体已在封闭缓冲液中稀释。通常在室温下进行一小时,但抗体浓度和培养时间需要优化。如前所示,倒掉二级抗体并清洗膜。
有几种不同的检测系统。如果二级抗体结合成酶,则在成像前将膜培养在适当的底物中。如果二级抗体是荧光偶联物,那么您可以直接进入成像步骤。可以使用X射线胶片或数字成像系统进行成像。将薄膜放入成像托盘中。将成像托盘放入成像系统。暴露时间很可能需要优化,以便清楚地检测与感兴趣的蛋白质相关的条带。