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使用ChIP-seq和ChIP-qPCR交联ChIP的详细程序和提示方法。
审查日期:2021年11月9日
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查看X-ChIP协议图。
ChIP-seq和ChIP-qPCR是强大的工具,可以实现蛋白质或组蛋白修饰到基因组的区域。在分离染色质后,使用针对感兴趣抗原的抗体来确定靶标是否与特定的DNA序列结合,或者绘制整个基因组的分布图(微阵列或DNA测序)。这可以在空间和时间上执行。
该协议提供了如何在细胞上执行ChIP的具体细节。使用该协议产生的输出DNA可以使用qPCR(ChIP-qPCR)或测序(ChIP-seq)进行分析。
甲醛被用来将蛋白质交联到DNA上。交叉链接是一个依赖于时间的过程,需要进行优化。
提示: 我们建议将样品交联2–30分钟。过度交联会降低抗原可及性和超声效率。表位也可以被屏蔽。添加甘氨酸以淬灭甲醛并终止交联反应。
1.1从两个汇合处开始150厘米2餐具(1x107-5倍107每个培养皿的细胞数)。通过直接向培养基中滴加甲醛至最终浓度0.75%,并在室温(RT)下轻轻旋转10分钟,将蛋白质与DNA交联。
1.2向培养基中添加最终浓度为125 mM的甘氨酸,并在室温下摇晃培养5分钟。
1.3用10 mL冷PBS冲洗细胞两次。
1.4加入5mL冷PBS,用细胞刮刀彻底刮净培养皿,然后转移到50mL试管中。
1.5向培养皿中添加3 mL PBS,再次刮除,将剩余的细胞转移到50 mL试管中。
1.6离心5分钟,4°C,1000 x g。
1.7小心吸取上清液,并将颗粒重新悬浮在ChIP裂解缓冲液中(750μL/1x107细胞)并在冰上孵育10分钟。
提示:使用悬浮细胞时,从1x107-5x107细胞开始,用0.75%甲醛和甘氨酸进行处理(步骤1)。通过离心法分离颗粒细胞(5分钟,1000 x g)。用冷PBS清洗3次,并在ChIP裂解缓冲液中重新悬浮颗粒(750μL/1x107细胞)。
2.1超声裂解,将DNA剪切到平均200-1000 bp的片段大小。这需要优化,因为不同的细胞株需要不同的声波时间。
提示:交联裂解物应经过一段时间的超声处理,以确定最佳条件。应在整个过程中移除样品,并按照步骤3所述分离DNA。应在1.5%琼脂糖凝胶上分析碎片大小,如图1所示。
2.2超声处理后,通过离心10分钟、4°C、8000 x g将细胞碎片颗粒化。将上清液转移到新管中。该染色质制剂将用于步骤4中的免疫沉淀(IP)
2.3取出50μL每个超声样品,以测定DNA浓度和片段大小。
提示:超声染色质可以在液氮中快速冷冻,并在-80°C下储存长达3个月。避免多次冻融。
图1(上图):对U2OS细胞进行5、10、15和20分钟的超声处理。随着时间的推移,碎片尺寸减小。在15分钟时观察到最佳碎片大小。
提示:声波作用时间过长会破坏核小体与DNA的相互作用,因此谱带大小不应小于200 bp。
超声染色质样品可用于计算后续IP的DNA浓度和测量DNA片段大小。
3.1向50µL染色质中添加70µL洗脱缓冲液。
3.2添加4.8µL 5 M NaCl和2µL RNase A(10 mg/mL),在65°C下摇晃过夜。
由于使用PCR纯化试剂盒时,高水平的RNA会干扰DNA纯化,因此使用RNase A处理样品。随着柱体饱和,屈服强度可能会严重降低。
3.3添加2µL蛋白酶K(20 mg/mL)并在60°C下摇晃1小时的同时培养。
用蛋白酶K处理样品,蛋白酶K切割与脂肪族和芳香族氨基酸的羧基相邻的肽键。蛋白质和DNA之间的交联被破坏,这有助于DNA纯化。
3.4使用PCR纯化试剂盒或苯酚:氯仿提取纯化DNA。
3.5为了测定DNA浓度,将5μL纯化的DNA转移到含有995μL TE的试管中,进行200倍稀释,并读取OD260。DNA的浓度(μg/mL)为OD260 x 10000。这用于计算染色质制剂的DNA浓度。在1.5%琼脂糖凝胶中使用100 bp DNA标记运行纯化的DNA,以确定片段大小。
4.1使用步骤2.2中制备的染色质。建议每个IP约含25μg DNA。用RIPA缓冲液将每个样品按1:10稀释。您需要一份特定抗体的样品和一份对照样品(仅限珠子)。取出50µL染色质作为输入样品,并将其储存在-20°C下,直至再次使用。
4.2将一级抗体添加到所有样品中,除了唯一的对照珠,并在4°C下旋转1h。应根据经验确定抗体的添加量;每25μg DNA中含有1-10μg抗体通常效果良好。
4.3蛋白质A/G珠的制备:如果同时使用蛋白质A和蛋白质G珠,则将等体积的蛋白质A和蛋白G珠混合,并在RIPA缓冲液中洗涤三次。吸入RIPA缓冲液,添加单链鲱鱼精子DNA至最终浓度75 ng/μL珠,添加BSA至最终浓度0.1μg/μL珠。添加RIPA缓冲液至珠体积的两倍,在室温下旋转培养30分钟。用RIPA缓冲溶液冲洗一次,添加RIPA缓冲器至珠体积两倍。
4.4将60µL封闭蛋白A/G珠添加到所有样品中,并在4°C下旋转IP过夜。
提示:应使用蛋白质A珠、蛋白质G珠或两者的混合物。表1显示了蛋白A和G珠对不同免疫球蛋白同种型的亲和力。
4.5将免疫沉淀样品以2000 x g离心1分钟,并去除上清液。
4.6进行以下清洗:一次在低盐清洗缓冲液中,一次在高盐清洗缓冲溶液中,一个在氯化锂清洗缓冲液里。每次清洗后,以2000 x g离心1分钟,并去除上清液。
提示:如果观察到高背景,可能需要额外清洗。或者,在步骤4.2之前,可以通过与蛋白A/G珠孵育1小时来预先清除超声染色质。在这一额外步骤中,将去除珠子上的任何非特异性结合。将上清液(超声染色质)转移到新试管中,并与抗体和珠培养,如步骤4.2所述。
5.1通过向蛋白A/G珠中添加120μL洗脱缓冲液洗脱DNA,并在30°C下缓慢涡流15分钟。
5.2以2000 x g离心1分钟,并将上清液转移到新鲜试管中。
5.3添加4.8µL 5 M NaCl和2µL RNase A(10 mg/mL),在65°C下摇晃过夜。
5.4添加2µL蛋白酶K(20 mg/mL)并在60°C下摇晃1小时的同时培养。
5.5DNA可以使用PCR纯化试剂盒或酚氯仿提取液进行纯化。
6.1DNA水平通常通过实时定量PCR进行测量。引物和探针通常使用实时PCR仪器提供的软件或使用在线设计工具进行设计。我们的网站上提供了一系列预先设计的引物和探针。
6.2或者,当使用ChIP-seq方法时,可以通过测序进行分析。使用该方案产生的DNA适合用作测序文库制备的输入。
提示:我们建议使用我们的故障排除技巧来针对您的特定实验条件优化此协议。
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