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荧光检测通常用于同时显示多个抗原。荧光色素可直接与一级或二级抗体或链霉亲和素结合。
在设计多色实验时,必须考虑两个关键参数。首先,应尽可能限制使用的荧光色素之间的光谱重叠。其次,如果使用间接检测方法,则必须避免检测试剂之间的交叉反应性(如果可能)。这通常是通过从不同物种中选择一级抗体来实现的,确保每个二级抗体在实验中只识别一个一级抗体。
如果一种主要抗体被生物素化,则可以使用来自同一物种的两种主要抗体。在这种方法中,首先用非生物素化抗体培养组织,然后用相应的氟铬偶联二级抗体培养组织。然后将组织与生物素化抗体一起孵育,然后与链亲和素缀合的荧光团一起孵育,该荧光团与缀合于初级抗体的生物素结合。由于内源性生物素,这种方法容易受到高背景染色的影响,尤其是在使用冷冻组织时。
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