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修改负片羧酸盐AM酯类导致不带电的疏水指示剂或螯合剂可以渗透细胞膜。
一旦进入细胞,细胞内酯酶类几乎在所有细胞类型中都存在,会水解AM组。产生的荧光指示剂或螯合剂然后会被包含在细胞内并积累。
我应该做什么储备溶液?
AM酯应使用高质量的无水二甲基亚砜(DMSO)进行重组。建议尽可能将AM酯保持在浓缩状态(例如1-10 mM),以便装载溶液中存在最小数量(理想情况下<0.1%)的二甲基亚砜。
如何存储AM酯类?
尽可能在同一天准备和使用解决方案。然而,如果您需要提前配制储备溶液,我们建议您将溶液作为等分溶液保存在-20°C的密封小瓶中,避光并保持无水。
像DMSO这样的溶剂很容易吸收水分,导致染料分解。
我可以使用AM酯类吗体外?
这只是一个介绍。任何特定染料和细胞的特定方案类型应从文献中获得。通常,AM酯的最终工作浓度在1-10µM之间。
孵化时间通常为30至60分钟。然而,不同细胞类型和指标的培养条件可能不同,理想情况下应针对每种细胞类型进行优化。
最好使用无血清培养基,并在室温或37ºC下培养(尽管在室温下装载通常更好)。
细胞应至少用新鲜无血清培养基清洗一次,以尽量减少细胞外背景荧光。如果使用含血清的介质进行加载,则可能需要增加AM酯的加载浓度,以补偿AM酯与血清蛋白的结合。
在某些情况下(例如MW>1000),负载的细胞可能需要在没有AM酯的培养基中进一步孵育20-60分钟,以允许细胞内酯酶完全处理AM酯。
我应该使用哪些表面活性剂和缓冲液?
可向加载介质中添加表面活性剂以帮助AM酯的分散;通常使用浓度<0.1%(wt/vol)。装载时,应预先混合AM酯和表面活性剂所需体积的DMSO储备溶液,然后分散到水介质中进行装载。
如果加载介质用碳酸氢盐缓冲,则应在5%CO下加载2防止介质因CO损失而碱化的大气2.