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2020年12月14日审核
蛋白质印迹是一项通过凝胶电泳按照分子量大小分离蛋白,然后再利用特异性抗体识别这些蛋白的技术。免疫检测通常使用由硝酸纤维素或 聚偏氟乙烯(聚偏二氟乙烯)制成的膜。将凝胶紧贴膜放置,蛋白在电流作用下从凝胶迁移到膜上。然后利用目标靶点特异性抗体对膜做进一步处理,再通过二抗和检测试剂让膜显色。
查看下方的西方印迹实验方案视频。
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如需提升西方印迹分析技能,请查看我们的免费西方印迹培训(可点播)。
这些缓冲液在 4 ℃ 下可保存数周,也可分装后在 -20 ℃ 下保存长达 1年。
测定 pH值值并将 pH值值调整至 6.8
测定 pH值值并将 pH值值调整至 8.3
对于大于 80千帕的蛋白,建议 SDS公司终浓度为 0.1%。
3–5% 牛奶或 英国标准协会(牛血清白蛋白)
加入 TBST(待定)缓冲液。充分混合后过滤。不过滤可能会有斑点沉积,这种小暗点会在显色时影响实验结果。
3.1 将等量的蛋白和分子量标志物上样至 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶孔中。细胞裂解液或组织匀浆的总蛋白上样量为 20-30微克纯化蛋白的上样量为 10-100纳克
3.2 在 100伏下跑胶 1-2 小时。
时间和电压可能需要优化。我们推荐按照制造商的说明进行操作。建议使用还原型凝胶,除非抗体数据表推荐使用非还原性条件。
凝胶百分比取决于目标蛋白的大小:
蛋白大小
凝胶百分比
4–40千Da
20%
12–45 kDa
15%
10-70千帕
12.5%
15-100千帕
10%
25-100千帕
8%
也可以使用梯度凝胶。
膜可以是硝酸纤维素,也可以是 聚偏氟乙烯用甲醇活化 聚偏氟乙烯1分钟,并在制备转膜层之前用转膜缓冲液冲洗 聚偏氟乙烯膜和膜
转膜层的制备如下:
图 1制备好的转膜层示例。
所有泳道:β-肌动蛋白抗体 - 内参对照 (ab8227)稀释度为 1/5000
泳1:希拉全细胞提取物
泳道 2:酵母细胞提取物
泳道 三:小鼠脑组织裂解液
实验方案由阿布卡姆根据阿布卡姆实验室使用阿布卡姆试剂和产品开展的实验“按原样”提供;在其他条件下使用实验方案得出的结果可能会有所不同。
蛋白质印迹的目的在于按照分子量大小在凝胶上分离蛋白。然后将蛋白转移到膜上,从而使用抗体对蛋白进行检测。在含有还原剂(如 β-巯基乙醇)的样本缓冲液中,95 ℃ 下加热样本 5到 10分钟。这样可以让线性化蛋白带上与其大小成正比的负电荷。
将凝胶放入电泳槽中并加入缓冲液,确保孔的顶部被缓冲液覆盖。所用凝胶的丙烯酰胺百分比取决于靶蛋白的分子量。将分子量标志物上样至第一泳道,然后将样本上样至相邻的孔中。所有样本均含有等量蛋白。所有样本完成上样后,添加电泳缓冲液,给电泳槽盖上盖子。打开电源,按照制造商的推荐设置凝胶槽中凝胶的电压。这时应该能够看到凝胶槽中有上升的气泡。跑胶,直到染料前沿充分移动至凝胶。
下一阶段是将蛋白从凝胶转移到膜。膜通常由硝化纤维或 聚偏氟乙烯制成。从凝胶槽中取出凝胶,并小心地将它从塑料盒中释放。切断孔和凝胶脚,并将凝胶放入转膜缓冲液中。将膜和凝胶夹在滤纸和海绵之间,制备转膜层。膜应靠近正极,凝胶应靠近负极。使用小滚筒去除凝胶和膜之间的气泡。夹住关闭的转膜箱,并将它浸入含有转膜缓冲液的转膜槽中。向外室加水,以保持系统冷却,并盖上盖子。打开电源,开始转移蛋白。时间和电压需要优化,请查看制造商的说明。
现在蛋白已经从凝胶转移到硝酸纤维素膜上了,可以用抗体检测目标蛋白了。膜可以从盒中取出,现在应该可以看到分子量标志物了。如有需要,可以用丽春红 S公司“”,“”,“”,“”,“”,“”,“”,“”5% 牛奶或牛血清白蛋白(英国标准协会)溶液在室温下孵育两小时或 4℃ 孵夜
膜封闭后,去除封闭缓冲液,在同一溶液中加入稀释的一抗。与之前一样,置于摇床上孵育。通常会在室温下孵育一抗 1小时或 4℃ 下孵育过夜。抗体浓度和孵育时间需要优化。如需任何指导,请查阅抗体数据表。倒出一抗,用洗涤缓冲液冲洗膜两次。随后在摇床洗涤膜 1次,时长 15分钟,再洗涤膜 三次,每次 10中国0.1% 吐温 20的 特里斯缓冲盐溶液(待定)或磷酸盐缓冲盐溶液(PBS)
倒掉洗涤缓冲液,在偶联二抗中孵育膜,二抗需先在封闭缓冲液中稀释。通常要在室温下孵育一小时,但抗体浓度和孵育时间需要优化。倒掉二抗,并按照上述步骤清洗膜。
有几种不同的检测系统。如果二抗与酶偶联,则成像前,应在合适的底物中孵育膜。如果二抗是荧光偶联二抗,可以直接进入成像步骤。成像时使用 X(X)射线胶片或数字成像系统。将膜放入成像托盘中。将成像托盘放入成像系统。为了清楚地检测与目标蛋白相关的条带,可能需要优化曝光时间。