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自 1992年克隆出原始的绿色荧光蛋白 (GFP)基因以来,可用的荧光标签种类激增 [图 1]。荧光标签的一大的优点是无毒,因此可以用于活细胞。尽管标签较大,但它们对大多数蛋白的破坏力极小1。
虽吉布GFP公司(分子量为 26.9千Da)是应用最广泛的荧光标签之一,但使用时仍需考虑几个要点。
图1:这些图显示了不同荧光蛋白的激发和发射光谱。详细信息见下方表1。
表1
如果您计划使用多个荧光标签,务必选择具有不同发射峰及激发峰的标签,以便使用激光靶向标签。如果发射峰重叠,将很难或者几乎无法对其进行区分。
为了获得清晰的信号并克服任何潜在的背景荧光,您通常会希望在可用光谱中使用最亮的荧光标签。亮度值是蛋白消光系数和量子产率的乘积。但是,很难解释得到的数字,因此通常会使用严格定义标签(条例草案EGFP公司)的荧光标签亮度值作为替代。
成熟定义了荧光标签正确折叠、形成发色团并开始发出荧光所需的时间。对于活细胞中的时间敏感事件,较短的成熟时间很重要。例如,GFP公司超级折叠体 (sfGFP)可在 10分钟内折叠,而 m橙色则可能需要 4小时才能折叠。
漂白是衡量光稳定性的指标,即激发后发色团失去发光能力的时间。如果您计划进行长时间的延时实验,请考虑光稳定性较高的标签。T型蓝宝石的漂白半衰期(t½每秒 x个个光子的初始发射速率降低至一半所需的时间)为 25秒,但 EGFP公司的漂白 t½为 174秒,所以更稳定。
与大多数蛋白一样,荧光标签受 pH值、温度和氧气浓度的影响。根据您计划使用的环境,您可能需要对条件做轻微调整或选择更合适的标签。
酸碱度值会影响激发峰和发射峰,并且大多数荧光标签对酸敏感:有些标签甚至会在 酸碱度值发生变化时改变荧光强度(条例草案pHTomato)pKa公司值是 酸碱度灵敏度的良好指标,因为它显示了一半发色团出现荧光时的 酸碱度值。
此外,温度和氧气浓度都会影响成熟时间:低氧条件会导致成熟时间变长,超出荧光标签最佳范围的温度也会延迟成熟时间(条例草案EGFP公司已优化为在 37摄氏度下工作)。但是,新型荧光标签(如 UnaG、一种从日本淡水鳗鱼 (日本鳗鲡)中分离出的 GFP)即使在氧气浓度较低时也会发出荧光三。
由于大多数荧光标签来源于水母或珊瑚蛋白,而您可能将其用于哺乳动物的细胞和组织,所以使用的氨基酸密码子可能存在种间差异。这会导致表达不佳,因此信号较低。
幸运的是,许多新版荧光标签已经经过密码子优化,可以反映哺乳动物细胞的偏好。以 GFP公司为例,尤尔根·哈斯和他的同事通过修饰 GFP公司密码子序列,将信号增强了 40-120 倍4。
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请务必确定标签是单体还是二聚体(单体通常用蛋白名称加“m”前缀表示,例如m樱桃色),以及是否影响您的实验。许多早期荧光标签容易形成寡聚物,而寡聚化可能会影响融合蛋白的生物学功能。例如,表皮生长因子是一种单体,在足够高的浓度下使用时会形成二聚体,这样会导致亚细胞器变形5或破坏 FRET公司等实验6。在绝大多数情况下,推荐使用真正的单体 FP
GFP公司和 m樱桃色产品