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微管系统是神经细胞骨架成分,可参与多种细胞功能。
陶(Tau)蛋白的C类端结合轴突微管,N个端结合神经质膜成分,说明陶(Tau)可能是两者之间的连接蛋白。
正常脑中陶(Tau)蛋白的细胞功能是促进微管组装和稳定性,可能参与神经元极性的建立和维持。短异构体决定细胞骨架的可塑性,而长异构体可能优先在其稳定性中发挥作用。
陶(Tau)蛋白存在多个磷酸化修饰位点,但过度磷酸化会减弱 陶(Tau)结合微管的能力,丧失正常生物功能,引起阿尔茨海默症(AD)
在阿尔茨海默病中,大脑中的神经元细胞骨架逐渐被破坏,取而代之的是成对螺旋丝(菲律宾法郎)和直丝的缠结,主要由陶(Tau)的过度磷酸化形式组成(PHF-头或AD P-Tau)
在阿尔茨海默病的大脑皮层中,O-GlcNA酰化大大减少,导致陶/MAPT磷酸化增加。
在大多数情况下,在胶质细胞和/或神经元中发现陶(Tau)蛋白沉积。
在神经元中表达。
异构体PNS-套在外周神经系统中表达,其余的在中枢神经系统中表达。
定位于细胞质溶胶,细胞膜,细胞骨架,轴突,树突。
主要存在于神经元的轴突、胞质中,并与质膜成分相关。
是分泌型蛋白,这种分泌依赖于蛋白质的展开,从细胞质转位到ERGIC公司(内质网-高尔基中间体),随后进入囊泡并分泌。
人(第10636页):存在9个异构体,分别为PNS-tau,tau-G:79-80 kDa(预测)胎儿头骨、头骨-A、头骨-B、头颈C、头骨-D、头颅-E、头盖-F:32-45 kDa(预测)
小鼠(第10637页):存在6个异构体,分别为PNS-tau,76 kDa(预测);Tau-A、Tau-B、Tau-C、Tau-D、Tau-E35-44千帕(预测)
大鼠(第1933页):存在8个异构体,分别为头-A、头-B、头-H:71-81 kDa(预测)陶-C、陶-D、陶-E、陶-F、陶-G:38-51 kDa(预测)
多个丝氨酸和苏氨酸残基的磷酸化修饰。
多聚泛素化修饰。
O-GlcNAc公司糖基化修饰。
PHF-头存在糖基化, 但正常大脑中的陶/MAPT不会糖基化。
陶(Tau)蛋白存在多种异构体,同时具有较为复杂的磷酸化、泛素化、糖基化等等翻译后修饰,所以可能会出现多条条带现像(例如:30-80 kDa)
由于陶(Tau)在不同样本中的异构体表达情况和修饰程度存在区别,实际检测时在不同样本间可能会出现蛋白条带大小变化的现象,并且检测结果可能与预测值不符。
请根据检测的陶(Tau)蛋白形式及修饰位点选择最合适的抗体和阳性对照。
中国陶(Tau)蛋白存在许多修饰位点和相应的检测抗体,其中有些位点修饰的磷酸化陶(Tau)蛋白可直接在大脑组织裂解液中检测到,比如磷酸S404(约92676),磷S396(约109390)等;有些位点需要药物刺激细胞后才能检测到,比如磷酸化T231(公元151559年)等。
在检测磷酸化陶(Tau)蛋白时,可设置磷酸酶去磷酸化的处理组,以判别磷酸化信号特异性。
陶:人、小鼠、大鼠脑组织裂解液。
p-Tau公司:请注意不同磷酸化位点的阳性对照可能存在区别,例如大脑组织裂解液,或药物刺激后的细胞裂解液(例如:使用冈田酸+Calyculin A处理的SH-SY5Y型细胞,请依据产品说明书选择最合适的药物)。
在实验中除了需要注意常规问题外,还要特别关注以下关键控制点:
样本制备
添加复合蛋白酶抑制剂以避免靶标蛋白降解。
批准
整个样本制备过程中,保持样本置于冰上。
通过布拉德福德分析、劳里分析或业务连续性分析分析
建议使用阳性对照。
转膜
建议转膜完成后使用丽春红染色,确定转膜是否成功。
由于陶(Tau)蛋白的分子量检测范围较大,请不要裁膜。
抗体孵育
请根据产品说明书选择合适的抗体工作浓度,背景较高或条带杂时可适当增加抗体稀释倍数。