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编号2是一个对于氧化应激反应非常重要的转录因子,它会结合在位于许多细胞保护基因启动子区域的抗氧化反应元件(是)上。
在正常情况下,编号2会被BCR(KEAP1)复合体泛素化修饰并在细胞质中降解。
在氧化应激反应中,亲电子代谢物会抑制BCR(KEAP1)复合体活性,促进NFE2L2/NRF2与一类小的马夫蛋白形成异二聚体,在细胞核内发生聚集现象。
编号2也会通过调节β-珠蛋白增强子活性参与β-珠蛋白簇基因的转录激活。
广谱表达
成年肌肉、肾脏、肺、肝组织和新生胎儿肌肉组织中高表达。
在正常情况下,编号2定位于胞质。
在中国编号2在细胞核中聚集 。
人(问题16236):附件1-3:65-68千Da(预测)
小鼠(Q60795):67kDa(预测)
鼠(O54968):附件1-2:67-68千帕(预测)
编号2具有乙酰化,糖基化,磷酸化,泛素化修饰
在正常情况下,编号2中国导致在工作分解结构中难以检测,加入MG132型能有效抑制该降解过程,增加编号2的检测信号。
氧化应激反应,亲电试剂,化学激活剂和自噬会导致NFE2L2/NRF2在细胞核内聚集,所以适当的样本刺激处理对于工作分解结构实验的成功至关重要。
编号2预测分子量68kDa但由于存在异构体及翻译后修饰,工作分解结构实验中可能观察到多条条带的情况,同时,实际检测到的分子量大于100kDa与预测分子量存在区别,建议不要裁膜。
2微米MG-132处理18小时的希拉或HepG2型全细胞裂解液
25µM毫克-132处理4小时的HCT 116型全细胞裂解液
30µM tBHQ处理4小时的MDA-MB-231型细胞核裂解液
人源重组编号2蛋白(约132356)
未经刺激处理的正常海拉、HCT 116、HepG2等全细胞裂解液
关键控制点
在实验中除了需要注意常规问题外,还要特别关注以下关键控制点:
样本制备
添加足够量的蛋白酶抑制剂以避免靶标蛋白降解。
超声破碎处理细胞以富集靶标蛋白。
通过布拉德福德分析、劳里分析或业务连续性分析分析测定样本总蛋白浓度。
电泳
至少上样 20微克总蛋白进行电泳。
转膜
强烈建议转膜完成后使用丽春红染色,确定转膜是否成功。
抗体孵育
强烈建议在进行工作分解结构实验时使用新鲜抗体,避免重复使用。