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胶原蛋白I作为一种纤维状胶原蛋白,是人体最丰富且重要的蛋白,对于皮肤、骨骼、结缔组织尤为重要。
折叠好的胶原蛋白I是异源三聚体的结构,即由2条α1链与1条α2这是一个很好的例子
胶原蛋白I分泌到胞外基质中后,经过蛋白酶的剪切形成成熟的胶原蛋白。成熟的胶原蛋白能自我组装成高度有序的胶原纤维。
胶原蛋白I存在翻译后修饰,一部分修饰参与胶原纤维合成,另一部分如异构化、外消旋化、糖基化等修饰,会改变胶原蛋白I的生物学功能,其终产物已被证明为一些疾病的生物标志物。
胶原蛋白I的突变也与一些骨骼和结缔组织疾病有关,如成骨不全症和皮肤过度松弛症(Ehlers-Danlos综合征)
几乎所有的结缔组织中都有表达。
骨骼、皮肤、肌腱、韧带、巩膜、角膜和血管中的主要蛋白。
细胞外基质。
人(P02452):138 KDa(预测)
大鼠(P02454):138千达(预测)
小鼠(第11087页):138 KDa(异构体1); 118千吨/年(异构体2)(预测)
羟基化
O(运行)-糖基化
胶原蛋白I本身在样本中存在很多的剪切位点,所以如果样本处理不当,很容易发生降解或是剪切,因此建议使用新鲜培养收集的细胞制备样本,同时提高裂解液中蛋白酶抑制剂的浓度,最大程度避免蛋白发生降解。
由于胶原蛋白比其他蛋白质更不稳定,检测应在 4摄氏度/冰上进行。
为防止胶原蛋白聚集,请注意实验试剂酸碱度值、温度以及胶原蛋白浓度。胶原蛋白易溶于酸性溶液,所以酸性环境(例如,50万醋酸,在 pH 2.5下保持 24小时)对胶原蛋白稳定性及可溶性非常重要。在碱性 酸碱度这是一个很好的例子
优化电泳条件:向样品中加入洗涤剂、还原剂和离液剂。胶原蛋白I电泳时可使用 6% 的丙烯酰胺凝胶。
向样品中添加400万尿素可改善电泳过程中胶原蛋白的分离。
推荐使用天然蛋白质标准品作为阳性和阴性对照。
在工作分解结构实验时,由于一些抗体产品(例如ab260043)的免疫原为重组片段,同时包含糖基化修饰位点,因此可能会存在多条条带现象。
人皮肤组织裂解液
在实验中除了需要注意常规问题外,还要特别关注以下关键控制点:
样本制备
添加足够量的复合蛋白酶抑制剂以避免靶标蛋白降解。
选择合适的裂解液来富集更多靶标蛋白。
整个样本制备过程中,保持样本置于冰上。
通过布拉德福德分析、劳里分析或业务连续性分析分析
电泳
至少上样20微克总蛋白进行电泳。
转膜
SDS公司至终浓度为0.1%。
对于分子量较大的靶标蛋白,建议使用0.45微米的聚偏氟乙烯膜。
对于分子量较大的靶标蛋白,建议转膜缓冲液中使用10%甲醇或更低浓度。
建议转膜完成后使用丽春红染色,确定转膜是否成功(如果选择荧光标记检测,请确保丽春红完全清洗干净)。
封闭
没有适用于所有体系的封闭液,请选择合适的封闭液。
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