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跨膜四超家族蛋白CD63型被认为是一个调控细胞外囊泡产生和胞内体货物分选的关键因子。
CD63型基因定位于人染色体2013年第12季度上,编码含237氨氨
CD63型蛋白结构包括N个端和C类端胞内结构域,以及跨膜间的细胞内连接环结构域2和结构域三,还有两个胞外环状结构域。CD63型可以与多种细胞表面蛋白和细胞内信号转导分子相互作用,介导运动、黏附和信号转导等一系列生物过程。
可在血小板中检测到(在蛋白质水平)。
发育不良痣,放射状生长期原发黑色素瘤,造血细胞,组织巨噬细胞。
细胞膜,胞内体,溶酶体
人(P08962):异构体1-3:17.2-25.6千Da(预测);
小鼠(第41731页):25.7千Da(预测)
大鼠(P28648):25.6千Da(预测)
糖
棕榈酰化。在未受刺激的血小板中棕榈酰化在一个低的基础水平;当血小板被凝血酶激活时,棕榈酰化水平增加()
由于CD63型存在糖基化等的蛋白翻译后,导致实际检测蛋白分子量大小与预测不符,实际大小可能在30到60千Da左右。
CD63型蛋白糖基化比较严重,因此工作分解结构检测到的条带可能都是弥散的条带。
不同组织和细胞里面由于CD63型糖基化程度的不同,因此可能会导致CD63型分子量在不同组织和细胞中有较大的差异。
CD63型是一个多次跨膜蛋白,煮样可能导致蛋白聚集。如果检测不到预期实验结果,推荐提取蛋白时不煮样。
推荐使用抑制分泌试剂(例如布雷费尔丁A)处理细胞,抑制CD63型分泌到细胞外,从而增强蛋白检测信号。
提取外泌体检测CD63型蛋白时,蛋白丰度十分重要。若提取的外泌体中CD63型含量较低,易出现无信号现象。更多的外泌体提取方案和研究指南见参考文献[1, 2]。
人
A375飞机全细胞裂解液
人骨骼肌组织
在实验中除了需要注意常规问题外,还要特别关注以下关键控制点:
样本制备
添加复合蛋白酶抑制剂以避免靶标蛋白降解。
整个样本制备过程中,保持样本置于冰上。
建议使用阳性和阴性对照。
CD63型是一个多次跨膜蛋白,强烈建议提取蛋白时不煮样。
电泳
至少上样20微克总蛋白进行电泳。
对于分子量较小的靶标蛋白(如分子量<25kDa)请使用较高浓度的分离胶进行电泳。
转膜
强烈建议转膜完成后使用丽春红染色,确定转膜是否成功。
由于CD63型会被糖基化修饰,蛋白分子量大小可能比预期的大,建议不要裁膜。