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核糖核酸修饰:概况
表观遗传学领域正在衍生出许多令人振奋的新分支。其中一条分支是核糖核酸修饰研究领域。 核糖核酸修饰检测和测序方法(例如 M6安培单碱基分辨率紫外交联沉淀, miCLIP)开发方面的最新进展意味着在任意种类的细胞或模型生物中发现新的 核糖核酸修饰并将该修饰定位 至不同种类的 核糖核酸项目核糖核酸修饰数量激增。目前,已知的 核糖核酸化学修饰 (Roundtree等人,2017年)已有 100多种。您会发现这些修饰存在于 mRNA、tRNA、rRNA和其他非编码核糖核酸(包括 微小RNA)上。这些修饰中,每一种修饰都有自己的功能,包括 核糖核酸结构、输出、稳定性和 信使核糖核酸剪接。该研究领域的未来一片光明;但仍有许多有关部分新修饰功能的内容尚待探索 。
图 1.RNA修饰在 信使核糖核酸和 tRNA上的分布。查看我们的核糖核酸修饰海报,了解更多内容。
在所有的核糖核酸物种中, tRNA包含的 核糖核酸修饰最多。 tRNA内,约五分之一的核苷酸被认为含有 核糖核酸修饰 (Kirchner等人,2015年)tRNA修饰非常多样化,需要通过多种酶逐步形成。通常情况下,您可以在 tRNA的反密码子环中发现修饰,修饰有助于通过协助密码子 -反密码子相互作用和防止移码来提高翻译效率 (Stuart等人,2003年)
核糖核酸修饰领域相对较新,但每天都在发展。在本节中,我们将对其中的一些方案进行介绍,并提供一些与 核糖核酸修饰相关的技巧和建议。
获得对您选择的核糖核酸修饰具有特异性的抗体可能困难重重。我们有许多被充分引用且经充分验证的 核糖核酸修饰抗体,包括曾被多篇知名论文引用的 6安培抗体,这些论文包括一篇发表在 自然方法、使用我们的 6安培抗体进行 6安培单碱基分辨率测序的论文 (Linder等人,2015年)同一 6安培抗体还被一篇 自然论文引用,该论文描述了 6安培在 信使核糖核酸稳定性方面的作用 (Mauer等人,2017年)请点击此处查看我们 核糖核酸修饰抗体的完整列表。
核糖核酸免疫沉淀 (RIP)
安息是一种基于抗体的技术,用于绘制体内 核糖核酸-蛋白质相互作用的图谱。目标 核糖核酸结合蛋白 (RBP)与其相关 核糖核酸一起免疫沉淀,以识别结合的转录本(mRNA、非编码 核糖核酸或病毒 RNA)通过实时 PCR、微阵列或测序检测转录本。
除转录和后续翻译之外,核糖核酸的功能还有很多。例如, 核糖核酸-蛋白质相互作用能够调节 信使核糖核酸和非编码 核糖核酸功能。对 核糖核酸潜在作用的新认识促进了新方法的开发,使得研究人员能够绘制 核糖核酸-工作质量安息就是这样一种研究单个蛋白质和核糖核酸分子之间物理关联的方案。
查看我们的完整RIP(独立电源)方案
不稳定的Khalila等人(2009)、Hendrickson等人(2009年)、Henkrickson等(2008年)和Rinn等人(2007年)
图 2:RIP(独立电源)实验方案流程示意图。(A)使用原生方法,不进行交联。方法 (B)使用甲醛交联。
裂开:技术考量
核糖核酸酶污染。使用不含 核糖核酸酶的试剂(如无 核糖核酸酶的吸头、试管和试剂瓶)避免污染。使用不含 DNA酶、不含 核糖核酸酶的超纯蒸馏水制备缓冲液和溶液。
严谨地设置对照。整个实验过程中应保持一个或多个阴性对照品,例如无抗体样本或来自基因敲除细胞或组织的免疫沉淀。不推荐使用敲除细胞进行阴性对照实验。
下游分析。从您的下拉列表中分离出来的 核糖核酸可以使用多种技术分析。根据您要回答的问题选择最佳方法,并使用多种方法确认您的结果。例如,您使用 RIP-seq型获取新信息RIP-qPCR进行确认。
削减是一种基于抗体的技术,用于研究与 核糖核酸免疫沉淀 (撕裂)相关的 核糖核酸-蛋白质相互作用,但与 安息的不同的是,削减路线核糖核酸结合蛋白与 RNA这种共价键是不可逆的,因而兼容严苛的纯化条件。与 安息不同,削减提供有关 核糖核酸上实际蛋白结合位点的信息。
削减可分为不同的类型,包括高通量测序 CLIP(HITS-CLIP)、光活化核糖核苷增强 夹子(PAR-CLIP)和单核苷酸分辨率交联免疫沉淀 (iCLIP)
您可以查看我们根据 Konig等人J.Vis。2011年到期“ICLIP-全转录组蛋白质 -核糖核酸相互作用的映射与个体核苷酸分辨率”改编的完整 削减实验方案。
图 3.夹子实验方案流程示意图。
削减:技术考量
4-硫尿苷预孵育 4-硫尿苷预孵育和 紫外线-A等等4-硫尿苷可增强某些蛋白质的交联。详情见完整实验方案。 优化抗体浓度开始实验之前,应优化所需的抗体量 (Huppertz等人,2014)无抗体样本是很好的阴性对照品。如果您以前未曾使用 削减对您的目标靶标进行过研究,您可以先使用在 IP(IP)中有效的一种抗体,在 IP(IP)中 的有效性即提示该抗体在 削减中也会有效。
米卡利普
尽管 6安培是真核生物 信使核糖核酸中含量最丰富的修饰碱基,但目前对其进行准确研究的方法仍存在局限性。绘制 6安培高分辨率图谱的新方法对理解这种表观遗传 核糖核酸修饰而言至关重要。
miCLIP公司可以对整个 核糖核酸中的单个 6安培残基和 6安培簇进行高分辨率检测(图 14)。使用 miCLIP、可以在人和小鼠 信使核糖核酸中以单核苷酸分辨率绘制 6安培和相关二甲基化形式 m6安(N6,2'-O-二甲基 腺苷)(Linder等人,2015年)
miCLIP公司适用于较小的 RNA该实验方案 (Linder等人,2015年)的作者发现,一类非编码小 RNA小 核仁 RNA(snoRNA)中存在 6安培修饰。若利用缺乏特异性且生物信息学存在挑战的旧技术,这一发现则是很难实现的。
您可以在此处查看我们完整的 miCLIP公司方案。
miCLIP:技术
非 100% 准确。该方法无法识别修饰残基的具体位置,只能确定 6安培位点的大致位置。
生物信息学 6安培中国数据分析使用基于已知共有序列的假设,这些序列含有 6安培残基,因此忽略了这些基序以外的修饰。
图 400万CLIP实验方案流程示意图
美国(LC/MS-MS)
与 DNA修饰类似,如果您可以使用 LC-MS/MS那么 液相色谱-质谱/质谱是量化总 核糖核酸内 核糖核酸修饰量的最佳方法。此外,类似于检测 DNA修饰,您可以使用绝对定量法,这种方法仅受您可以用作样本 检测标准品的同位素标准品的限制。
使用该技术并结合 RIP(RIP-MS)您可以确定您的 核糖核酸修饰抗体是否与您的目标修饰进行了结合, 而且可以查看它是否与任何其他非特异性修饰进行了结合。如果您利用 RIP输入和下 下拉样本 得到了 液相色谱-质谱/质谱数据,您应该可以看到,相较 输入而言,下拉样本中的目标修饰得到了富集。 您还可以使用这些数据检测其他修饰,查看您的样本中是否有其他成分增加,以检测非特异性抗体结合。
LC/MS-MS:技术考量
技术挑战。质谱设备非常昂贵且非常专业。机器本身需要大量的维护,并且往往要求其自身的技术人员掌握一切运行情况。机器操作非常复杂,需要专门的培训,因此您自己可能很难获得这种类型的质谱数据。如果您无法购买自己的 液相色谱/质谱联用获取
核糖核酸修饰对照实验
由于 核糖核酸修饰的性质,其化学结构通常极为相似。为了确保您从您的抗体中获得最准确的结果,您需要在您的模型系统中对其进行完全检测。核糖核酸修饰抗体的对照品可以使用一系列的应用来完成。为简化您的 核糖核酸观看
核糖核酸酶处理
不管您是进行 国际商会/国际卫生理事会还是进行 RIP-qPCR都有必要为您的实验样本设置一个经 RNA酶处理的对 照品 (Delatte等人,2016)举个例子,如果您在您的实验 国际控股公司样本中看到一个清晰、明亮的信号,但 在 RNA酶处理的对照样本中未得到信号,您可以确信您得到的信号来自 RNA而不是来自非特异性 来源的背景信号。这意味着抗体识别的是 核糖核酸内的修饰,而非 DNA内的修饰。
挪威船级社处理
除了 核糖核酸酶处理的对照品,您还应该设置经 挪威船级社处理的对照品。如果您担心您的 核糖核酸修饰抗体 正在识别 DNA内的一种类似修饰,最好用 挪威船级社处理您的样本,并对此进行检测。许多修饰都会同时存在于 核糖核酸和 DNA内,所以这个问题很常见。举个例子,DNA内的 5摄氏度与 核糖核酸内的 5摄氏度的化学修饰相同。
竞争法检测
确保 核糖核酸修饰抗体特异性的另一种方法是使用竞争法检测。竞争法检测使用的是包含合成修饰的寡 核苷酸,可与您的抗体一并预孵育 (Meyer等人,2012年)您在您的应用(例如 国际商会/国际卫生理事会或斑点印迹) 中使用这种预孵育抗体时,与单独使用抗体染色的样本比较后,您应该会看到获得的信号有所降低。 您可以尝试将竞争性寡核苷酸添加到您的抗体溶液中,并不断增加溶液浓度;您会看到信号呈梯度递 减,反映了您添加到抗体中的竞争物的量。例如,尝试按 0纳克、10纳克、100纳克和 1微克的梯度添加竞 争性寡核苷酸。
斑点印迹法 (斑点)
使用 核糖核酸更多细节合成 核糖核酸分子,可以将 其作为最佳阳性对照品。同样,装载未修饰的分子或含有不同修饰的分子可以作为阴性对照品,并帮助您测量任何非特异性结合或交叉反应性。
RIP-MS系统
要是您能够使用 LC-MS/MS那么 液相色谱-质谱/质谱确实是检测 核糖核酸修饰抗体特异性的最佳方法 (Kellner等人,2014)使用该技术并结合 RIP(RIP-MS)您可以确定您的抗体是否仅与您的目标修饰进行了结合。
参考文献
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