多重免疫荧光/免疫组织化学（mIF/IHC）是研究肿瘤空间微环境的一种较新工具。 它在临床和转化应用方面都有很高的潜力，在癌症免疫治疗中的近期应用——特别是在发现生物标记物以更准确地预测患者对免疫治疗的反应以及在组织标本供应有限的情况下。
2019年对研究进行的系统回顾和荟萃分析表明，与传统的单链IHC分析相比，mIF/IHC改进了对10种实体瘤类型PD-1/PDL-1检查点阻断免疫治疗反应的预测（1）。 2021年初发表的另一项研究也表明，mIF/IHC技术可以提供多站点再现性（2）。
在这里，我们讨论在组织学实验室建立mIF/IHC的前分析成分时应优先考虑哪些因素。
1.病理学家在开发mIF小组中的角色是什么？
病理学家应参与mIF/IHC面板开发过程中的每一步，从面板设计到最终质量控制（QC）。 它们可以在生物标记物选择、验证、处理、质量控制和组织标本评估等问题上提供有价值的科学和临床指导。 病理学家也有助于解释数据。 归根结底，任何mIF/IHC研究的生产力都取决于病理学家、项目科学家和免疫学家（如果需要）之间的成功合作。
2.我应该在什么时候完成开发mIF/IHC面板的工作和费用？
虽然这项工作的最佳工具并不总是显而易见的，但主要的决定因素应该始终是手头的科学问题，其次是样品可用性。
由于mIF/IHC面板设计和验证比传统的单链IHC要求更高，因此只有在一些传统的单线IHC分析无法回答关键问题时才应使用它。 例如，如果所需数据仅限于全滑坡或区域水平的多个标志物的丰度，并且每个病例都有多张幻灯片，那么传统的单法IHC将适用。 然而，如果所需数据包括同一细胞内多个标记的共定位、不同表型的单个细胞之间的邻近距离测量及其相对空间分布，则mIF/IHC信息更丰富。 最后，如果样品很珍贵或很难获得，这可能证明开发mIF/IHC解决方案是合理的。 然而，这个决定是主观的，高度依赖于实验室和项目。
3.实验室已经验证了许多用于常规诊断工作的传统单链IHC协议。我们如何利用我们已经投入到这些协议中的艰苦工作来产生一个经过验证的mIF/IHC面板？
有几种方法可以利用传统的单线IHC为多路面板开发提供信息。 最简单的方法是开发一种迭代的传统单链IHC染色策略，使用AEC作为染色原，依次进行抗体染色、全滑扫描和抗体剥离/去除，然后融合和对齐多个亮场图像进行分析。
但这种方法很耗时（目前是手动的）。 一种更好的替代方法是选择一种mIF/IHC染色系统，其中主要抗体未标记。 这使得相同的一级抗体结合条件（阻断、浓度、稀释剂、温度和时间）能够在复合物中重现。 如果初级抗体直接用寡聚物、半抗原或金属标签标记，则应重新确定或至少确认结合条件。
一旦建立了敏感性和特异性，一级抗体结合条件应保持不变。 其他重要考虑因素包括测试染色顺序、荧光团选择和浓度； 针对传统单法IHC的验证； 和再现性测试。 尽管有其他步骤，但这是将传统单链IHC分析用于mIF/IHC小组的最佳方法。
4.我们能做些什么来缓解病理学家对荧光图像的不适，并促进他们对这些新技术的兴趣？
病理学家感到不适的部分原因是缺乏时间和免疫荧光方面的经验。 不幸的是，mIF/IHC的复杂性在两方面增加了时间需求。 首先，多层生物标记数据需要在多个通道之间来回切换（与基于光学显微镜的传统模式识别不同）。 其次，数字化也是一个经验问题，对于那些更习惯于手动幻灯片审查的病理学家来说，这也是一个挑战。 虽然大多数用户更容易将显色染色分为阳性组（1–3+），但免疫荧光具有更大的线性动态范围，病理学家通常对此缺乏经验。 幸运的是，通过适当的培训、数据支持的标准阈值方法，以及对这项新技术的好处的教育，病理学家可以对mIF/IHC更加满意。
此外，许多数字病理分析程序现在都提供了伪彩色选项，可以通过单独显示每个标记（或任何组合，如绿色+红色信号=黄色信号）来方便新用户，就像它们在标准数字病理（或甚至传统显微镜）图像中出现一样。
5.如果病理学家或组织学家对使用软件进行量化感到不舒服怎么办？
与感兴趣区域（ROI）演示相比，整个幻灯片图像（WSI）的可视化是一种潜在的方法，可以使病理学家对软件评分感到满意，尤其是如果可以生成伪IHC WSI（见图1）。 大多数病理学家和组织学家应该能够通过单独显示每个标记或组合来手动为mIF/IHC WSI评分，就像标准数字病理解决方案一样。
图1。 使用mIF/IHC染色的邻近正常肝组织的代表性图像及其“伪IHC”的模拟。A.mIF/IHC:DAPI（蓝色）、CD3（绿色）、泛细胞角蛋白（红色）； B.假IHC:DAPI（蓝色），泛细胞角蛋白（棕色）； C.伪IHC:DAPI（蓝色），CD3（棕色）； D.伪IHC:DAPI（蓝色）。 放大倍数：200倍。 图片来源：Jeffrey Chun Tatt Lim，新加坡A*STAR分子细胞生物学研究所。
6.我们需要一个用于mIF/IHC的暗室吗？
将直接试剂和组织成像过程结合起来的多重免疫荧光协议可以在标准的湿实验室中进行。 进入暗室是可选的。
7.mIF/IHC的组织厚度是否有特殊考虑？
适当的组织厚度是高质量mIF/IHC图像的关键。 常规FFPE组织切割为4-5μm，通常为一个细胞厚度，适合mIF/IHC分析。
某些组织类型需要考虑不同的截面厚度。 例如，大脑和中枢神经系统（CNS）组织需要8–10μm的切片来显示神经元。 另一方面，在组织样本有限的情况下，如核心活检或淋巴结研究，3μm是可以接受的，但厚度低于2μm有可能导致结果不准确。
8.我可以使用现有的传统单链IHC管道进行组织处理、切片和染色吗？
组织加工和切片应在相同条件下进行。 请记住，mIF/IHC面板的优化和验证按以下顺序进行：i）传统单工IHC； ii）单工IF； 和iii）mIF分析。 这些染色是在连续的组织切片中进行的。
将传统单工IHC转换为mIF的染色协议可能会有所不同。 这一点在MITRE研究中得到了强调，研究人员必须改变二次检测系统，以在两种测定之间实现相同的信号强度（2）。
9.每次染色应进行哪些控制？
每次染色应进行三项主要控制。 第一种是阳性对照，它应该代表先前的特征组织。 这有助于确定自动染色器是否正确分配了所有试剂，如果需要成像后归一化以减轻批处理影响，则可以作为归一化控制。 如果对批次进行细分，则可能适合进行几个阳性对照。
第二种是同型或特异性对照。 所有初级抗体应替换为非特异性抗体，以揭示染色方案中的非初级试剂对每个通道中观察到的信号的贡献程度。
第三种是自体荧光控制。 此控制应省略所有荧光灯。 这将揭示组织中结合的自体荧光，以及所有未设计为直接产生每个通道中荧光信号的试剂的荧光。
10.冷冻样品可以用于mIF/IHC吗？
mIF/IHC通常不在冷冻样品上进行，因为新鲜冷冻组织中的组织结构没有FFPE样品中保存得好。 例外情况是对小鼠大脑和中枢神经系统的研究，主要在8–10μm厚的冷冻组织中进行。
一种选择是使用典型厚度为4-5μm的冷冻转化FFPE（尤其是临床试验样品），转化发生在组织块或载玻片水平。
11.对具有挑战性的样本类型是否有特殊考虑？
骨和中枢神经系统等组织倾向于显示高背景染色，这可能会在区分特异性和非特异性染色信号时对某些标记物造成挑战。 通过使用较薄的切片、优化阻断步骤和使用单克隆初级抗体，可以降低出现此问题的可能性。 使用选择的抗体稀释液和封闭试剂可以进一步显著降低背景并增强染色强度。
此外，由于脂褐素水平较高，中枢神经系统组织会出现自体荧光挑战。 在苏丹黑或脂褐素淬火溶液中培养载玻片有助于缓解这个问题。 同样的溶液也可用于骨髓中的IF背景染色。 这一问题可以通过利用多光谱成像和光谱解混的技术来进一步解决，该技术允许将自发荧光分离到离散通道和每个感兴趣的生物标志物，而不考虑强度或光谱重叠，从而提供数据准确性和定量信息。
12.保存切好的载玻片和纸巾块的最佳做法是什么？
尽管组织可以以不同的方式保存，但FFPE是医院和研究中心保存临床样本的主要方法。 研究在理解福尔马林固定化学和FFPE组织中生物分子降解方面引发了一些争议。
尽管如此，共识是将组织保存在石蜡块中（理想情况下，切割表面覆盖一层石蜡层，以避免组织氧化），保持室温干燥环境中，并避光。 保存完好的区块可以成功储存长达10年。 此后，可能会发生明显的组织降解，因此在开始任何研究之前，应确认10年以上组织块的形态质量（H&E）和抗原性。
尽管载玻片的保存方案也存在争议，但主要共识是使用新鲜的载玻片，而无需从组织切片中去除石蜡，并将其保存在滑盒中4°C）的温度下。 一些人建议将切好的载玻片存放在带有氮气的干燥室中（以避免组织氧化），但并非所有实验室都配备有氮气室。 三个月后，一些标记物中的表位会发生衰退； 因此，mIF/IHC研究的最佳实践是使用不到三个月的幻灯片。
13.在一个通道中混合两个标记是否可行且有用？
通常，可以安全地混合单个通道中的两个标记。 然而，最好是分离标记物，除非它们是病理学家可以解释的诊断鸡尾酒的一部分。 特别是在mIF/IHC中，将两个标记物混合在一个通道中的一种常见方法是将多个肿瘤/癌症标记物混合到一个通道-例如，泛细胞角蛋白和任何其他细胞角蛋白（例如肝脏样本中的CK18），或SOX10和EPCAM以突出肿瘤和上皮。
14.合理的面板尺寸是多少？
一个小组中标记的数量取决于技术平台的特征和研究的目标。 在转化和临床研究方面，更多并不一定更好。 对于一个特定的项目，一个三标记小组可能就足够了——例如，通过与泛细胞角蛋白或CD45（3）共同染色对PD-L1进行评分。 对于需要多个标记来发现表达谱的广泛探索性研究，考虑一个具有大规模功能的平台。 然而，对于任何使用的小组或方法，验证（方法和数据）对成功至关重要。
15.如何选择荧光灯调色板？ 匹配标记物、染色化学和成像平台的一些策略是什么？
目标生物标记物的性质、用于检测它的抗体以及荧光团本身将决定该过程这一步的决定（4）。 目标生物标记物的表达模式（核、细胞质或膜）、表达丰度（少数到数百个细胞）和每个细胞内的表达水平是重要因素，以及生物标记物在非目标细胞中可能的真实或异常表达。
检测系统、初级和次级抗体以及选择的荧光分子对于确定最终结果的特异性（信噪比）至关重要。 由于荧光团具有由其发射波长决定的各种自然发生的强度，经验法则是尝试将弱荧光团与丰富或强烈的生物标记物相匹配。
平台结果的其他决定因素将取决于先前的优化过程，以找到正确的抗体和荧光团浓度。
16.在对大量样品进行染色时，如何检测和缓解批次效应？
即使在优化和质量控制过程完善之后，批量效应也始终存在风险。 作为QA过程中的一个重要步骤，经验丰富的IHC技术人员、科学家或病理学家应在继续分析之前检查幻灯片/图像是否存在异常，包括批处理效应。 根据手头的问题和异常的类型，批量效应可能是可以挽救的。 训练有素的病理学家可以轻松发现和管理批量效应。 在优化和标准化每张幻灯片的预分析变量时，遵循完全相同的步骤通常会将其频率降低到10%以下。
17.在对这些样品进行成像时，如何检测和缓解批次效应？
主图像（设置优化后由扫描仪直接生成的图像）中的批处理效果是由设置更改或扫描仪的机械特性驱动的，例如光源、载物台和参考校准、滑盖/滑盖厚度以及其他变量。 检测这些细微差别和批量效应通常需要经验丰富的实验室科学家或病理学家的投入。 他们对QA/QC过程的监督对于解决这一阶段的批处理效果至关重要，因为主图像决定了要生成的下一批图像。
次图像通常是基于参考库和未混合算法生成的。 由于幻灯片到幻灯片的可变性或染色异常，这种方法可能会出现批量错误，所以正确的染色是关键。 算法也可能因基于各种荧光团的丰度和分布的染色变化而产生偏差，使其成为批处理错误的潜在来源。 毕竟，算法还依赖于图像输入和参考库，无论是合成的还是测量的。
同样，在训练算法进行图像分割和评分后，在图像分析过程中可能会出现批量效应问题。这与上述所有点有关，加上人工智能（AI）准确预测进一步分割和评分的能力。因此， 批处理效应必须由训练有素的科学家和病理学家团队进行QA/QC，以确定其影响，并避免数据报告中的错误，这些错误可能会损害这种强大技术的准确性。
18.我可以从现有的经验证的流式细胞仪面板构建mIF/IHC面板吗？
可能； 然而，大多数流式细胞术抗体与IHC不相容，尤其是与IHC-石蜡不相容。 这很可能是因为细胞悬浮液中抗原的表位呈现可能与IHC组织切片不同。
在流式细胞术中，荧光素通常直接与一级抗体结合。 相反，大多数IHC和mIF/IHC协议使用间接标记方法，需要次级抗体进行信号放大。 流抗体检测的良好信噪比对mIF/IHC来说可能是一个挑战，因为对于不太丰富或表达较弱的蛋白质，信号可能显得微弱或无法检测到。
Flow和IHC科学家对细胞表型检测也可能有不同的观点。 例如，IHC科学家可能只使用FOXP3抗体来鉴定调节性T细胞，而流动科学家通常使用谱系标记。 在将流面板转换为mIF/IHC之前，建议与免疫学家和病理学家进行文献回顾和讨论。
19.我是否需要特定的设备来实现多路复用，或者我的荧光扫描兼容数字病理扫描仪是否足够？
这取决于检测目标标记的数量。 通过兼容的探测器设置，组织病理学实验室中配备的大多数传统成像仪/扫描仪可以轻松实现四色mIF/IHC。 一些非多路特定扫描仪可以调整以检测多达六个标记。 对于七种颜色以外的视觉效果，建议使用多光谱复合成像仪/扫描仪，但不是“必备”
20.高效执行WSI需要考虑哪些因素？
组织微阵列（TMA）是执行mIF/IHC最具成本效益的方法。 然而，即使TMA是由病理学家构建的，经过几次切片后，TMA组织的形态和组成也会发生变化。 建议在开始项目之前进行H&E染色，以确保TMA仍然适用。
在一个资源相对有限的环境中，WSI——甚至全滑分析——将是模拟病理检查的理想方法。 然而，必须小心区分“全幻灯片分析”和“全幻灯片检查”。病理学家确实需要检查整个幻灯片，但不需要对整个幻灯片进行量化。 即使重点放在肿瘤区域，一些生物标志物也只在热点区域进行评分。 将正确的答案和正确的科学问题放在正确的背景下是取得成功的关键。
感谢JEDI——多重IHC/IF全球标准化委员会。
