人脐带沃顿胶状间充质干细胞向子宫内膜细胞的分化

摘要

背景

沃顿的胶质衍生间充质干细胞（WJ-MSCs）具有分化为多种细胞类型的能力，是一种新型且有前景的组织工程策略。我们表征了WJ间充质干细胞分化为子宫内膜上皮细胞（EEC）样和子宫内膜基质细胞（ESC）样细胞，并评估了17β-雌二醇和8-Br-cAMP对分化系统的影响。

方法

WJ-MSCs以两种方式分别分化为EEC-like和ESC-like细胞：在对照/分化培养基（17β-雌二醇，生长因子）中与ESCs共培养；并在对照/分化培养基中培养（8-Br-cAMP单独或8-Br-cAM加17β-雌激素和生长因子）。采用三种信号通路抑制剂（SB203580、PD98059、H89）研究WJ-MSC向ESC样细胞分化的机制。免疫荧光、western blot和流式细胞术分析上皮标记物和基质细胞标记物的表达。酶联免疫吸附试验用于测试与ESC样细胞分化相关的分泌蛋白的产生。

结果

1μM的17β-雌二醇下调波形蛋白和CD13，上调细胞角蛋白和CD9蛋白，促进WJ-MSCs在共培养体系中分化为EEC样细胞。0.5mM的8-Br-cAMP上调波形蛋白和CD13，下调CK和CD9，促进WJ MSC分化为ESC样细胞。催乳素（PRL）和胰岛素样生长因子结合蛋白1（IGFBP1）上调，蛋白激酶A（PKA）信号通路激活，而细胞外信号调节（ERK）1/2和p38丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）未受影响。

结论

1μM的17β-雌二醇是促进WJ-MSCs分化为EEC样细胞的良好诱导剂。8-Br-cAMP联合雌激素和生长因子可诱导WJ-MSCs分化为ESC样细胞。在WJ-MSCs分化为ESC样细胞的过程中，治疗上调了PRL和IGFBP1，激活了PKA信号通路，而ERK1/2和p38 MAPK不受影响。这些发现为治疗子宫内膜损伤和其他子宫内膜疾病提供了一种有希望的方法，并为WJ-MSCs在临床实践中的新应用提供了建议。

背景

人类子宫内膜是一种独特的组织，会经历类固醇诱导的每月增殖周期（卵泡期再生）、分化周期（黄体期）和脱落周期（月经）[1]. 在月经期，灵长类动物子宫内膜的功能层脱落，然后在增殖期进行修复，形成新的腺上皮层，为新的月经周期做准备[1]. 适当的子宫内膜厚度对胚胎着床和妊娠的实现起着关键作用[2]. 排卵时内膜变薄对子宫内膜的损害可能导致妊娠失败[三]. 尽管确定了影响子宫内膜生长的某些因素，但很少有药物可以改善子宫内膜的损伤[4]子宫内膜损伤的机制尚不清楚。

干细胞治疗是一种新的、有前途的策略，对许多疾病的治疗可能比单一药物治疗更有效[5,6,7,8,9]. 干细胞在损伤组织修复中的作用有两种方式：通过分泌相关细胞因子[7]或通过分化损伤部位的细胞类型来发挥其原有功能[8]. 人脐带沃顿胶状间充质干细胞（WJ-MSCs）具有增殖快、生物学特性稳定、免疫原性低、易于分离等特点[10]. 此外，WJ-MSCs可分泌大量细胞因子，无致瘤作用[11,12]. WJ-MSCs比骨髓MSCs具有更强的增殖、分化和迁移能力，是细胞移植和器官替代组织工程的理想种子细胞[10]. 先前的研究表明，从沃顿果冻中分离出的干细胞能够分化为脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞、神经元和少突胶质细胞[10]. 然而，迄今为止尚未研究其分化为子宫内膜细胞的潜力。我们之前的研究表明，WJ-MSCs可以通过分泌血管内皮生长因子（VEGF）改善对人子宫内膜基质细胞（ESCs）的损伤[13]. 然而，WJ-MSCs是否具有分化为子宫内膜细胞的潜能，并有助于修复子宫内膜损伤或子宫内膜细胞更新，目前尚不明确。

在本研究中，我们首先通过建立分化诱导系统，探索WJ-MSCs分化为子宫内膜上皮细胞（EEC）样和ESC样细胞的潜力。通过评估子宫内膜细胞形态、标记物和功能来鉴定EEC样和ESC样细胞。对潜在机制的分析表明，参与WJ-MSCs分化为ESC样细胞的是蛋白激酶A（PKA）信号通路，而非p38丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）和细胞外信号调节（ERK）-1/2信号通路。

方法

WJ-MSC的分离、培养和鉴定

脐带是从健康的足月分娩中采集的。人体生物标本的采集和使用得到了南通大学附属医院伦理委员会的批准。样品在无血清Dulbecco改良鹰培养基F12（DMEM/F-12；Hyclone，Logan，UT，USA；https://promo.gelifesciences.com/gl/hyclone/products/media.html)并立即转移到实验室。清洗后，将脐带样本切成2–3厘米的切片，取出脐带血管，收集沃顿氏果冻并切碎。将切片置于含有补充有10%胎牛血清的DMEM/F-12培养基（FBS；Gibco，Waltham，MA，USA；http://www.thermofisher.com网站)并在含5%CO的增湿大气中37°C下培养₂.

用于鉴定WJ-MSCs的抗体为抗CD14-FITC（ab28061）、抗CD45-FITC、抗CD79a-PE、抗CD90-FITC和抗CD34-PE，均来自英国剑桥；网址：http://www.abcam.cn). 用流式细胞仪（FACS Calibur；BD Biosciences，USA；http://www.bdbiosciences.com/cn/home).

当第2代细胞（P2）达到80%融合时，将其置于成骨分化培养基中（A1007201；Invitrogen，Waltham，MA，USA；http://www.thermofisher.com网站)或脂肪生成分化培养基（A1007001；Invitrogen）。每3天更换一次培养基。在第10天和第14天，分别进行茜素红染色和油红O染色，以鉴定成骨细胞和脂肪细胞。

子宫内膜细胞的分离、培养和鉴定

子宫内膜样本来自南通大学附属医院。无子宫内膜异常的壁内或有蒂浆膜下子宫肌瘤患者为合格候选人。在进行子宫切除术之前，没有一名女性服用药物或接受激素治疗至少6个月。所有样本均在患者签署知情同意书后获得，程序经南通大学附属医院伦理委员会批准。收集的子宫内膜样本在无菌PBS中清洗数次，以去除红细胞，并切成小块（约1 mm^三)，用0.1%的I型胶原酶消化（C0130；美国密苏里州圣路易斯Sigma-Aldrich；网址：http://www.sigmaaldrich.com)在37°C下保持1 h，并通过两种不同孔径的筛子过滤所得细胞悬浮液，首先是100μm，然后是40μm（100μm cell Strainer，40μm cell-Rainer，#431752，#431760；美国纽约州科宁；https://www.corning.com/cn/zh/products/lifeciences.html)将ESC和EEC分开。将ESCs和ECCs接种到含有补充10%FBS的DMEM-F12培养基的培养瓶中。然后分别用抗细胞角蛋白和抗波形蛋白抗体对EECs和ESCs进行染色，并用免疫荧光法进行鉴定。

共培养体系诱导WJ-MSCs分化为EEC样细胞

P2 WJ-MSCs和ESCs在Transwell系统中共培养（24 mm Transwell和0.4μm孔聚碳酸酯膜插入物，#3412；康宁）。简而言之，WJ-MSCs在6孔板底部以6 × 10⁵细胞/孔和ESC以6的密度接种在Transwell膜上 × 10⁴细胞/孔分离细胞，但允许可溶性因子在它们之间自由传递。为了观察内源性因子（由ESCs分泌）和外源性因子（雌激素和生长因子）对WJ-MSCs上皮分化的影响，我们设立了三个实验组。a组（对照组）在对照培养基（DMEM/F12加2%FBS）中共培养体系的底部和膜上培养WJ-MSCs；在b组中，WJ MSC与ESCs在对照培养基中共培养；c组WJ-MSCs与ESCs在含有2%FBS的DMEM/F12分化培养基中共培养，1 × 10^–7mol/L 17β-雌二醇（E2）（E2758；Sigma-Aldrich），10 ng/ml表皮生长因子（EGF）（100-47；Peprotech，美国；https://www.peprotech.com)、10 ng/ml转化生长因子-β1（TGF-β1）（100-21；肽基）和10 ng/ml血小板衍生生长因子-BB（PDGF-BB）（100-14B；肽基化）。培养基每2天更换一次，培养持续21天。

在共培养体系中建立四个不同雌激素水平处理组，以探讨E2对WJ-MSCs上皮分化的影响。在a组（对照组）中，在底部和膜上培养WJ MSCs，并用对照培养基（含2%FBS的DMEM/F12）喂养。在b、c和d组中，WJ-MSCs与ESCs和不同浓度的E2（1 × 10^–8, 1 × 10^–7，或1 × 10^–6mol/L）。培养基每2天更换一次，培养持续21天。

条件培养基诱导WJ-MSCs分化为ESC样细胞

P2 WJ-MSCs在6孔板底部培养，密度为6 × 10⁵细胞/孔，在低血清培养基（含2%FBS的DMEM/F12）中培养前隔夜无血清，采用以下处理：a组，对照组；b组，0.5 mM 8-Br-CAMP（B5386；Sigma-Aldrich）加上10 nM E2、10 ng/ml EGF、10 ng-ml TGF-β1和10 ng/ml PDGF-BB；c组，0.5 mM 8-Br-CAMP；d组为10 nM E2、10 ng/ml EGF、10 ng/ml TGF-β1和10 ng/mlPDGF-BB。每3天更换一次培养基，继续培养21天。

免疫荧光染色鉴定原代培养的EEC和ESCs

对基质细胞系标记物波形蛋白（抗波形蛋白）和CD13（抗CD13）的抗体以及上皮细胞系标记剂细胞角蛋白（抗细胞角蛋白）和CD9（抗CD9）的抗体进行染色，以确定WJ-MSC向EEC和ESC的分化。简而言之，用4%多聚甲醛固定细胞并用1%牛血清白蛋白封闭。然后用兔单克隆抗波形蛋白抗体（ab92547；Abcam）和小鼠单克隆抗CD13抗体（ab7417；Abcam）或兔单克隆抗角蛋白抗体（ab76126；Abcan）在4℃孵育过夜和小鼠单克隆抗CD9抗体（ab2215；Abcam）。第二天，用山羊抗兔FITC（ab6717；Abcam）和山羊抗小鼠PE（ab5889；Abcam）对细胞进行染色。用Hoechst（Beyotime生物技术研究所，江苏，中国；https://www.beyotime.com). 染色细胞在荧光显微镜下观察（日本东京奥林巴斯）。

蛋白质印迹分析

蛋白质通过SDS-PAGE溶解并转移到硝化纤维素膜上。用5%脱脂奶粉将膜封闭1 h，然后用兔单克隆抗波形蛋白抗体（ab92547；Abcam）或兔单克隆抗细胞角蛋白抗体（ab76126；Abcam）或小鼠单克隆抗CD13抗体（ab7417；Abcan）或鼠单克隆抗GAPDH抗体（ab8245；Abca姆）在4℃孵育过夜。第二天，用含0.1%吐温20（TBST）的Tris缓冲盐水进行三次洗涤（每次10分钟），以去除初级抗体。二级抗体为山羊抗兔IgG H&L（ab6721；Abcam）或山羊抗鼠IgG H&L（ab6789；Abcam），在室温下持续2h。使用Alpha Innotech成像系统（Protein Simple，Santa Clara，CA，USA）通过增强化学发光显示免疫反应性。蛋白质带强度标准化为GAPDH水平。每个实验至少重复三次。

酶联免疫吸附试验

根据制造商的说明（SEA846Hu，SEA052Hu；USCN，USA；网址：http://www.uscnk.com). PRL和IGFBP1分析的最低检测限分别为0.65和0.065 ng/ml。

抑制PKA、ERK1/2和p38 MAPK的激活

采用三种不同的信号通路抑制剂研究WJ-MSC向ESCs分化的机制。P2 WJ-MSCs在6孔板底部培养，密度为6 × 10⁵用含有10%FBS的DMEM/F12培养基和以下处理的细胞/孔：a组，无抑制组；b组，10μM SB203580（p38 MAPK通路抑制剂）（#5633；细胞信号技术，美国；https://www.cst-c.com.cn); c组，10μM PD98059（ERK1/2通路抑制剂）（#9900；细胞信号技术）；d组，10μM H89（PKA通路抑制剂）（2910；Tocris Bioscience，Bristol，UK；网址：https://www.tocris.com); e组，无分化组。治疗2小时后，将a–d组的培养基改为低血清培养基（含2%FBS的DMEM/F12），其中含有0.5 mM 8-Br-CAMP加10 nM E2、10 ng/ml EGF、10 ng/ml TGF-β1和10 ng/ml PDGF-BB；e组培养基改为低血清培养基（含2%FBS的DMEM/F12），继续培养21天。

流式细胞术

五组WJ-MSCs治疗21天，在室温下消化并用单克隆抗体染色30分钟，然后进行流式细胞仪分析。用于确认WJ-MSCs分化为ESC样和EEC样细胞的抗体为抗波形蛋白-PE（ab8978；Abcam）、抗CD13-PE（ab140233；Abcam）、抗细胞角蛋白-Alexa Fluor 647（ab192468；Abcan）和抗CD9-FITC（ab34162；Abca姆）。用流式细胞仪（BriCyte E6；中国迈瑞；http://www.mindray.com/cn/index.html).

统计分析

数据表示为平均值 ± SD.使用GraphPad Prism 6软件进行统计分析。Western blot、ELISA和流式细胞术数据（图1B、C,3C– E类和6A、B、D)通过独立样本进行评估t吨测试比较两组之间的平均值，以及在三个或更多组之间进行多重比较的单向方差分析（ANOVA）。统计学第页<0.05被认为是显著的。

图1

WJ-MSCs在共培养体系中分化为EEC样细胞。(A类)三组诱导分化后WJ-MSCs的形态学变化：（a）在对照培养基（DMEM/F12和2%FBS）共培养系统的底部和膜中培养的WJ-MSC。（b） WJ-MSCs与ESCs在对照培养基中共培养；（c） WJ-MSCs与ESCs在分化培养基（DMEM/F12，含2%FBS和1 × 10⁷mol/l 17β-E2、10 ng/ml TGF、10 ng/ml EGF和10 ng/ml PDGF-BB）。Bar表示200μm。(B类)Western blot分析三组WJ-MSCs分离的细胞裂解液中的细胞角蛋白、CD9和波形蛋白。用抗细胞角蛋白（CK）、抗波形蛋白（Vim）和抗CD13抗体检测到的融合蛋白以及抗GAPDH（GD）抗体作为负荷对照。误差条代表SEM*第页 < 0.05. (C类)Western blot分析WJ-MSCs细胞裂解液中的细胞角蛋白、CD9和波形蛋白，以显示17β-E2浓度对WJ-MSC分化的影响。用抗CK、抗Vim和抗CD13抗体检测融合蛋白，并使用抗GD抗体作为负荷控制。a组，WJ-MSCs在底部和膜上培养，用对照培养基喂养；b、c和d组，WJ-MSCs与不同浓度17β-E2（1）的ESCs共培养 × 10^–8, 1 × 10^–7，或1 × 10^–6mol/L）。误差条代表SEM*第页 < 0.05

结果

WJ-MSC培养和鉴定

将切碎的沃顿果冻样品置于组织培养瓶中培养，6-7天后，检测到一些从组织中分离出来的三角形和纺锤形细胞。1周后贴壁细胞达到80%融合。P2处的细胞呈纺锤形，汇合后在烧瓶表面形成漩涡状图案（附加锉刀1：图S1A）。

流式细胞术结果表明WJ-MSCs具有特征性MSC表型。CD14、CD34、CD45、CD79a和HLA-DR呈阴性，CD105和CD90呈阳性（附加文件1：图S1B）。

如前所述，测试WJ-MSCs向成骨和成脂谱系的分化潜能。在成骨诱导培养基中培养的细胞显示出碱性磷酸酶活性，而在脂肪诱导培养基培养的细胞在细胞质中积累了脂滴（附加文件1：图S1C）。在常规生长培养基中保存的WJ-MSCs中未观察到脂质空泡或矿化基质形成（附加文件1：图S1C）。

子宫内膜细胞的培养和鉴定

P1 ESCs是纺锤形成纤维细胞样细胞（附加文件2：图S2A）和P1 EEC是比基质细胞更圆的多边形细胞（附加文件2：图S2B）。通过免疫荧光染色鉴定培养的ESC和EEC，结果表明ESC对基质细胞标记物vimentin（Vim）和CD13呈阳性，对上皮细胞标记物cytokeratin（CK）和CD9呈阴性（附加文件2：图S2C）。相反，CK和CD9的EEC阳性，Vim和CD13的EEC阴性（附加文件2：图S2D）。

共培养系统上调CK和CD9，下调Vim和CD133，表明WJ MSC分化为EEC样细胞

建立三个实验组，观察内源性因子（由ESCs分泌）和外源性因子（雌激素和生长因子）对WJ-MSCs分化的影响。通过免疫荧光和western blot分析，分析培养细胞的细胞形态和上皮细胞标记物CK和CD9以及基质细胞标记物Vim和CD13的表达。

在培养大约21天后，c组细胞形成一个肿块，而b组细胞显示出不规则的生长模式，与对照组（a组）观察到的螺旋生长模式不同（图第1页). western blot分析显示，c组上皮细胞标记物CK显著上调，而基质细胞标记物Vim和CD13下调。对照组（a组）和b组之间未观察到显著差异（图1B年).

免疫荧光分析显示类似结果。a组和b组的未分化WJ-MSCs对CK、CD9、Vim和CD13呈阳性反应，而c组的WJ-MSC对Vim和CD13呈轻度阳性反应，对CK和CD9呈强阳性反应（图2).

图2

共培养体系中WJ-MSC分化为EEC样细胞的免疫荧光染色。(A类)三组细胞分别用抗波形蛋白抗体（绿色）、抗CD13（红色）和Hoechst核染料（蓝色）染色。第四列中显示的合并图像。(B类)三组细胞用抗细胞角蛋白抗体（绿色）、抗CD9（红色）和Hoechst核染料（蓝色）染色。a组，共培养体系底部和膜上均培养的WJ-MSCs在对照培养基中：WJ-MSC对波形蛋白、CD13、细胞角蛋白和CD9呈强阳性染色。b组，WJ-MSCs与ESCs在对照培养基中共培养：细胞仍被波形蛋白、CD13、细胞角蛋白和CD9阳性染色。c组，WJ-MSCs与ESCs在分化培养基中共培养：细胞角蛋白和CD9呈强阳性染色，而波形蛋白和CD13呈弱阳性染色。Bar表示200μm

这些结果表明，只有内源性因子（ESCs分泌）和外源性因子（雌激素和生长因子）的共同作用才能诱导WJ MSCs分化为EEC样细胞。由于雌激素对女性的月经周期有强烈影响，在下一个实验中，我们进一步研究了E2在WJ-MSCs分化为EEC样细胞中的作用。

共培养体系中诱导WJ-MSCs分化为EEC样细胞的最佳E2浓度的确定

为了探讨E2对WJ-MSCs上皮分化的影响，我们建立了四个组，并在共培养系统中用不同剂量的雌激素进行处理。在a组中，WJ-MSCs在对照培养基（含2%FBS的DMEM/F12）的底部和膜上培养。在b、c和d组中，WJ-MSCs与ESCs和不同浓度的E2（1 × 10^–8, 1 × 10^–7、和1 × 10^–6mol/L）在分化培养基中培养。细胞培养21天，通过western blot分析检测上皮细胞标记物CK和基质细胞标记物Vim和CD13。结果表明，在含有1 × 10^–6mol/L E2（d组）（图1摄氏度). 这表明1 × 10^–6mol/L E2为WJ-MSCs分化为上皮细胞系提供了最佳微环境。

在条件培养基中培养WJ-MSCs，上调Vim和CD13，下调CK和CD9，诱导WJ-MSC分化为ESC样细胞

8-Br-CAMP在BM-MSC的早期研究中显示了其分化作用[14]. 本研究结果表明，WJ-MSCs在分化培养基中培养21天后，呈纺锤形，与ESCs相似（图3A级)b组（Br-CAMP、雌激素和生长因子组）和c组（Br-CAMP组）。为了确定WJ-MSCs分化为ESC样细胞的最佳条件培养基，我们通过western blot、免疫荧光和ELISA分析进一步表征了各组ESCs标记物。

图3

WJ-MSCs分化为ESC样细胞。(A类)WJ-MSCs的形态学变化。（a） 对照组：细胞仍呈三角形和纺锤形。（b） 0.5 mM 8-Br-CAMP加上10 nM 17β-雌二醇（E2）和10 ng/ml表皮生长因子（EGF）、10 ng/ml转化生长因子（TGF）和10 ng/ml血小板衍生生长因子-BB（PDGF-BB）：细胞变短，两端略圆。它们变小，细胞质减少。（c） 0.5 mM 8-Br-CAMP组：细胞趋势与b组相似，但不太明显。（d） 10 nM 17β-E2和10 ng/ml EGF、10 ng/ml TGF和10 ng/ml PDGF-BB组：细胞比对照组长且窄。他们排列得一团糟。Bar表示200μm。(B类)Western blot分析四组WJ-MSCs分离的细胞裂解液中的细胞角蛋白、CD9和波形蛋白。用抗细胞角蛋白（CK）、抗波形蛋白（Vim）和抗CD13抗体检测到的融合蛋白以及抗GAPDH（GD）抗体作为负荷对照。(C类,D类,E类)代表三个独立实验的western blot和ELISA数据的量化。误差条代表SEM*第页 < 0.05. d天，PRL催乳素，IGFBP1胰岛素样生长因子结合蛋白1

免疫荧光分析显示a组WJ-MSCs CK、CD9、Vim和CD13阳性。与对照组相比，b组（Br-CAMP、雌激素和生长因子组）的细胞仅基质细胞标记物Vim和CD13呈阳性，而上皮标记物CK和CD9呈阴性。c组（Br-CAMP组）也观察到类似的趋势，尽管CK和CD9染色较弱。d组（雌激素和生长因子组）的所有四个标记物均减少（图4).

图4

四组中WJ-MSC分化为ESC样细胞的免疫荧光染色：（a）未处理的WJ-MSC；（b） 8-Br-CAMP和E2处理的WJ-MSCs；（c） 8-Br-CAMP处理的WJ-MSCs；（d） 用E2处理WJ-MSCs。(A类)四组细胞分别用抗波形蛋白抗体（绿色）、抗CD13（红色）和Hoechst核染料（蓝色）染色。第四列中显示的合并图像。(B类)四组细胞用抗细胞角蛋白抗体（绿色）、抗CD9（红色）和Hoechst核染料（蓝色）染色。第四列中显示的合并图像。Bar表示200μm

Western blot分析显示，基质标记物Vim和CD13在b组和c组上调，在b组表达较高。上皮标记物CK在b和c组显著下调，b组的表达弱于c组。d组未检测到基质细胞标记物（图3B、C).

在条件培养基中培养WJ-MSCs可增加PRL和IGFBP1的分泌

为了进一步证实MSCs分化为ESCs的结果，在WJ-MSC经上述四种不同方案治疗后，通过检测标记物PRL和IGFBP1来表征ESC样细胞。ELISA结果显示，在相同时间点（第7天、第14天和第21天），与对照组相比，b组和c组的PRL和IGFBP1显著上调，PRL和IGFBP1在第14天的表达水平最高。此外，用8-Br-cAMP联合雌激素和生长因子治疗的WJ-MSCs与单独用8-Br-cAMP治疗的WJ MSCs相比，IGFBP1和PRL蛋白表达有显著差异(第页 < 0.001）（图3D、E)表明分化的WJ-MSCs具有与ESCs相同的分泌模式。

激活PKA而非p38 MAPK和ERK1/2促进WJ-MSC向ESC样细胞分化

根据我们之前的研究，WJ-MSC具有修复受损ESC的能力。我们目前的研究表明，分化的WJ-MSCs不仅表达ESC标记物，还具有ESC的分泌功能。然而，WJ-MSCs转化为ESC样细胞的信号通路尚不清楚。因此，我们研究了p38 MAPK、ERK1/2和PKA通路。流式细胞术数据显示⁺/确认^–细胞和CD13⁺/CD9（CD9）^–a组（无抑制组）、b组（SB203580组）和c组（PD98059组）的细胞数显著高于d组（H89组）和e组（无分化组）(第页 < 0.001; 图5A、B级和6A级). Western blot分析显示，与无抑制组相比，b组和c组的基质标记物Vim和CD13没有显著降低，而d组和e组的基质标志物Vim与CD13降低。d组和e组的上皮标记物CK显著增加，而b组和c组的上皮标志物CK没有增加（图6C、D).

图5

H89阻断8-Br-cAMP诱导的WJ-MSCs向ESC样细胞分化。(A类)使用抗波形蛋白和CD13抗体对五组细胞进行流式细胞术分析。(B类)使用细胞角蛋白和CD9抗体对五组细胞进行流式细胞术分析。（a） 无抑制组；（b） p38 MAPK阻滞组；（c） ERK1/2阻滞组；（d） PKA阻断组；（e） 无分化组。用8-Br-cAMP处理a–d组细胞21天

图6

流式细胞术、蛋白质印迹和ELISA数据的定量，以研究p38 MAPK、ERK1/2和PKA激活对WJ MSCs分化为ESC样细胞的影响。(A类)Vim流式细胞术数据的量化⁺/CK公司^–细胞和CD13⁺/CD9（CD9）^–各组细胞百分比。（a） 无抑制组；（b） p38 MAPK阻断组；（c） ERK1/2阻滞组；（d） PKA阻断组；（e） 无分化组。a–d组细胞用8-Br-cAMP处理21天。数据代表三个独立实验的结果。误差条代表SEM*第页 < 0.05; ***第页 < 0.001. (B类)代表三个独立实验的ELISA数据的量化。误差条代表SEM***第页 < 0.001. (C类)Western blot分析五组WJ-MSCs分离的细胞裂解液中的细胞角蛋白（CK）、CD9和波形蛋白（Vim）。用抗CK、抗Vim和抗CD13抗体检测融合蛋白，并使用抗GAPDH（GD）抗体作为负荷控制。(D类)代表三个独立实验的western blot数据的量化。误差条代表SEM*第页 < 0.05; **第页 < 0.005. PRL催乳素、IGFBP1胰岛素样生长因子结合蛋白1

ELISA显示，与无抑制组相比，WJ MSC分泌的PRL和IGFBP1水平在d组和e组降低，但在b组和c组没有降低（图6亿). 综上所述，这些结果表明H89而非SB203580和PD98059（一种特异性PKA抑制剂）阻止WJ-MSC分化为ESC样细胞。

讨论

WJ-MSCs被视为临床治疗和科研应用的理想干细胞来源[10]. 几项研究表明，WJ-MSCs在特定条件下可以分化为所有三个胚胎层的细胞[15,16,17,18]它们在组织修复或再生中发挥作用。Xu等人[19]使用含有重组人角朊细胞生长因子的条件培养基诱导WJ-MSCs分化为汗腺样细胞（SGCs），发现分化后的SGCs在体内修复受损汗腺和受损皮肤方面具有潜在的治疗应用价值。Qu等人[20]发现层粘连蛋白411通过Pdx1和Ngn3信号通路作为WJ MSC分化为胰岛素产生细胞（IPC）的有效诱导剂，并且输注分化的IPC改善了1型糖尿病大鼠的症状和存活率。Aghajanova等人[14]用雌二醇和孕酮、骨形态发生蛋白2和PKA通路激活剂（8-Br-CAMP）处理骨髓源性MSCs，诱导其分化为ESCs。然而，他们没有显示骨髓源MSC向EEC的分化及其相关机制。虽然WJ-MSCs修复子宫内膜损伤的能力之前已有报道[13,21]WJ-MSCs的子宫内膜分化潜能迄今尚未被研究。由于WJ-MSCs比骨髓源性MSCs具有更强的增殖、分化和迁移能力[10]，我们假设，如果WJ MSC能够分化为EECs和ESCs，那么它们可能对治疗子宫内膜损伤有价值。在本研究中，我们首先探讨了WJ-MSCs分化为子宫内膜样细胞（EEC-like和ESC-like细胞）的能力。我们成功地设计了一种分化策略，并证实了两种细胞类型的分化介质或方法不同。

Li等人[22]结果表明，WJ-MSCs与大鼠泌尿生殖窦基质细胞孵育并移植到体内肾包膜后分化为前列腺上皮样细胞，前列腺上皮细胞特异性标记物包括前列腺特异性抗原的表达证实了这一点。他们的研究表明，WJ-MSCs具有向上皮样细胞分化的能力，而上皮样细胞通常来源于内皮层。Garzón等人[23,24]证明了WJ-MSCs分化为口腔粘膜、皮肤上皮细胞和角膜上皮细胞的潜能。为了检测WJ MSC分化为EEC样细胞的能力，我们使用Transwell共培养系统将ESCs与WJ MSC一起培养。在这个系统中，细胞因子可以自由通过0.4微米孔径的碳聚酯薄膜，而细胞则不能。实验结果表明，在生长因子、功能蛋白、ESCs分泌的细胞因子以及添加的因子（TGF-β1、EGF和PDGF-BB）和雌激素的共同作用下，WJ-MSCs开始呈团状生长，而不是对照组中观察到的螺旋状。此外，免疫荧光和western blot分析显示，上皮细胞标记物CK和CD9显著升高，基质细胞标记物Vim和CD13显著降低。由于雌激素在女性月经周期中起着重要作用，我们进一步研究了雌激素浓度对WJ-MSCs分化为EEC样细胞的影响。E2的梯度浓度为1 × 10^–8–1 × 10^–6采用mol/L Western blot分析比较CK、Vim和CD13的表达。结果表明 × 10^–6mol/L E2为WJ-MSCs分化为EEC样细胞提供了最佳微环境。

在临床上，有许多疾病和紊乱会导致子宫内膜损伤，如阿瑟曼综合征、不孕和闭经[25,26]. 患有这些疾病的患者往往会感到极度悲伤。因此，对病理损伤后子宫内膜修复的研究变得越来越重要。骨髓间充质干细胞分化为子宫内膜基质样细胞可能为临床治疗这些疾病以及建立生理月经和妊娠提供新的方法。Aghajanova等人[14]据报道，8-Br-CAMP是BM-MSCs分化为ESCs的诱导因子。我们之前的研究证实，WJ-MSCs可以通过分泌VEGF来修复受损的子宫内膜。在本研究中，我们研究了8-Br-cAMP作为WJ-MSCs分化的诱导剂。最近的研究表明，卵巢切除免疫缺陷小鼠的子宫内膜可以在月经后修复，这表明雌激素在月经后具有修复作用[27]. 然而，另一项研究表明，雌激素和孕激素受体的表达在子宫内膜再生阶段增加[28]. 在本研究中，我们研究了不同浓度的雌激素对WJ-MSCs向ESC样细胞分化的促进作用。结果表明，诱导21天后，8-Br-CAMP处理组和8-Br-CAMP+雌激素组的基质细胞标记物Vim和CD13显著升高，上皮细胞标记物CK19和CD9降低；然而，在包括雌激素在内的培养基中诱导更有效。在8-Br-CAMP加雌激素组，IGFBP1在第14天开始增加，并在诱导21天后达到峰值。PRL在第14天也显著升高。此外，我们发现10 nM雌激素加速了分化，这表明其效果是剂量依赖性的。

cAMP依赖性PKA通路在促进细胞增殖和抑制细胞凋亡中发挥作用[29]. H89是一种cAMP/PKA信号通路抑制剂，可以阻断PKA信号途径[30]. p38 MAPK通路参与MSCs分泌VEGF的过程。SB203580是p38 MAPK的特异性抑制剂，可显著阻断缺氧诱导因子1诱导的MSCs分泌VEGF，而缺氧可诱导MSCs分化为血管内皮细胞[31]. 虽然低氧诱导的VEGF分泌参与MSCs向内皮细胞的分化，但p38 MAPK通路是否在WJ-MSCs向子宫内膜样细胞的分化中起作用尚不清楚。Xu等人[32]发现VEGF通过ERK1/2途径诱导MSCs分化为血管内皮细胞，PD98059阻断VEGF介导的MSCs分化。然而，目前还没有关于ERK1/2信号通路对MSCs分化为子宫内膜细胞的影响的报道。

我们以前的研究表明，ESCs在修复子宫内膜损伤方面发挥着不可替代的作用；因此，我们进一步探讨了WJ-MSCs分化为ESC样细胞的分子机制。我们使用H89检测cAMP/PKA通路在WJ-MSCs分化为ESC样细胞中的作用。WJ-MSCs经10μM H89处理2h后加入分化培养基。流式细胞术、蛋白质印迹和ELISA分析用于确定细胞分化的程度。我们发现用H89阻断PKA通路会降低Vim的百分比⁺/CK公司^–细胞和CD13⁺/CD9（CD9）^–流式细胞术和western-blot分析显示，它们抑制WJ-MSCs的分化。然而，通过流式细胞术、western blot和ELISA分析检测蛋白质/激素含量表明，阻断ERK1/2和p38 MAPK通路并未显著影响WJ-MSCs向ESC样细胞的分化，这与对照组的结果相当。这些结果表明，cAMP/PKA通路可能有助于WJ-MSCs分化为ESC样细胞，而ERK1/2和p38 MAPK通路则不参与。ERK1/2和p38 MAPK两种抑制剂在不同浓度下对WJ-MSCs的影响尚未评估，这应在未来的研究中进行研究。

最近，据报道，多系分化应激耐受（Muse）细胞是一种新的非肿瘤性多能干细胞群体[33]. 它们能够自发或在介质特异性诱导下从所有三个胚胎胚层分化为细胞。骨髓、皮肤细胞和脂肪组织中已证明Muse细胞的存在。Ratajczak等人[34,35]研究发现，成人组织中含有大量非常罕见的干细胞，称为非常小的胚胎样干细胞（VSELs）。VSEL存在于脐带血和骨髓中，具有多功能性和分泌生长因子的能力等生物学特性，对人类的细胞治疗策略具有吸引力[36]. 目前纯化小鼠VSELs的策略是对任何略小于红细胞（4-5mm）的圆形有核细胞进行分选，并表达Sca1⁺林⁻CD45型⁻表型[37]. 然而，没有证据证明Muse细胞或VSEL可以从沃顿果冻中分离出来[37]. 在我们的研究中，WJ-MSCs是从沃顿氏果冻中提取的，在去除所有脐血和血管后，将其收集并切碎。造血标记物阴性（补充文件1：图S1B），因此与从脐血和骨髓等造血器官分离的MSC不同。此外，我们在相控显微镜下未在纯化的WJ-MSCs中观察到这些圆形细胞。我们通过细胞形态和表面标记物在分化前后严格鉴定了WJ MSCs，因此得出结论，这类细胞在特定的微环境中分化。

结论

本研究首次研究WJ-MSCs在特定微环境中分化为EEC样和ESC样细胞的能力。1μM的E2是促进WJ-MSCs分化为EEC样细胞的良好诱导剂。8-Br-cAMP联合雌激素和生长因子可通过激活PKA信号通路诱导WJ-MSCs分化为ESC样细胞，而对ERK1/2或p38 MAPK通路无影响。这些发现可能为治疗子宫内膜损伤和其他子宫内膜疾病提供了一种有希望的方法，并可能增加WJ-MSCs在临床实践中的应用。