Engineering glycoside hydrolase stability by the introduction of zinc binding

Ellinghaus, T.L.; Pereira, J.H.; McAndrew, R.P.; Welner, D.H.; DeGiovanni, A.M.; Guenther, J.M.; Tran, H.M.; Feldman, T.; Simmons, B.A.; Sale, K.L.; Adams, P.D.

doi:10.1107/S2059798318006678

研究论文

结构
生物学

国际标准编号：2059-7983

第74卷| 第7部分| 2018年7月| 第702-710页

https://doi.org/10.1107/S2059798318006678

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引入锌结合的工程糖苷水解酶稳定性

^一美国加州埃默里维尔联合生物能源研究所，邮编：94608，^b条美国加州伯克利劳伦斯伯克利国家实验室分子生物物理学和综合生物成像部，邮编94720，^c（c）美国加利福尼亚州利弗莫尔桑迪亚国家实验室生物与工程科学中心，邮编：94551，^d日美国加州伯克利市劳伦斯伯克利国家实验室生物系统与工程部，邮编：94720^{e（电子）}美国加州大学伯克利分校生物工程系，邮编：94720
^*通信电子邮件：pdadams@lbl.gov

美国加利福尼亚大学T.O.Yeates编辑(2018年1月31日收到； 2018年5月1日接受；在线2018年6月27日)

开发强健的酶，特别是纤维素酶，是“第二代”生物燃料生物途径取得成功的关键一步。用于降解生物量的酶的典型来源包括嗜中温生物和嗜热生物。来自糖苷水解酶家族9的内切葡聚糖酶J30最初通过堆肥衍生细菌群的宏基因组分析鉴定。这些专为有利于目标原料生长而进行的研究已经证明能够鉴定出具有相当耐热性的纤维素酶。J30的氨基酸序列与先前分析的酶的氨基酸序列同源性相对较低。作为一种酶，它结合了可测量的活性、相对较低的最佳温度（50°C）和适度的耐热性，为旨在提高稳定性的结构优化提供了潜力。这里晶体结构野生型J30的变体与所设计的具有改进的工业应用特性的三重突变体变体一起呈现。通过引入结构锌²⁺位置，耐热性增加了10℃以上，同时催化最佳温度增加了5℃以上。

关键词：糖苷水解酶;蛋白质工程;热稳定性;X射线晶体学.

PDB参考：野生型J30，5u0h;J30 CCH，5u2o

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1.简介

对气候、能源需求增加、化石燃料长期供应有限的担忧以及道德考虑，促进了对更可持续的木质纤维素“第二代”生物燃料的研究。它们依赖于从柳枝稷等原料中解构纤维素和半纤维素单糖。这个过程中的一个步骤，糖化，使用热稳定性和化学稳定性强的糖苷的混合物水解酶类（GH）。这些混合物通常利用内切葡聚糖酶的组合活性（酶代码EC3.2.1.4），β-葡萄糖苷酶（EC 3.2.1.21）和纤维二水解酶（EC 3.2.1.91和EC 3.2.1.176；CBH）。碳水化合物活性酶数据库（CAZy；https://www.cazy.org)目前根据氨基酸序列的相似性列出了153个不同的GH家族。这种分类有助于根据独立于底物特异性的结构、机械和进化方面对GH进行分组。

J30，一种具有抗第页-硝基苯纤维二糖(第页NPC），其主要产物是纤维二糖，通过来自适应柳枝稷的微生物群落（Allgaier）的宏基因组数据进行鉴定和分析等。, 2010 ; 德哈塞勒等。, 2013 ; 格拉登等。, 2014 ). 它可能的来源是适度嗜热的细菌复合热杆菌KWC4，其催化最佳温度为50℃。它被注释为GH家族9成员，由一个N端Ig样结构域和一个C端组成催化域。基于dbCAN的初始注释表明，类Ig结构域中存在碳水化合物结合模块（CBM；例如，CBM家族30基序）。然而，最新的dbCAN2元服务器(https://cys.bios.niu.edu/dbCAN2)不识别CBM。具有54%的序列同源性T.堆肥是J30的最接近同源物。在那些具有溶解结构的材料中，树枝状堆肥CelG（LC-CelG；PDB条目3x17像素; 奥卡诺等。, 2015 )最相似的是41%的身份，其次是Cel9A酸性嗜酸脂环杆菌（AaCel9A；PDB条目3盎司8; 佩雷拉等。, 2009 )和Cel9A来自热梭菌（CtCel9A；PDB条目1个信用证; M.B.Lascombe、H.Souchon、M.Juy和P.M.Alzari，未发表作品），分别具有32%和31%的身份。在蛋白质数据库中发现的不太相似的家族成员中（伯曼等。, 2000 )是没有类Ig结构域的晶体结构，以及携带C末端相邻族3 CBM的晶体结构（Okano）等。, 2015).

我们已经解决了J30到1.7的结构奥分辨率。这种酶是GH家族9成员中仅有的三种结构之一，不含结构钙²⁺和锌²⁺离子，其他是来自副溶血性弧菌（PDB条目3小时7升; 纽约SGX结构基因组研究中心，未发表的工作）和来自深发光杆菌（PpGlcNase；PDB条目5平方厘米; 本田等。, 2016 ). 在具有解决结构的其他构件中，那些表现出比J30高得多的耐热性的构件包含一到四个结构金属离子（Schubot等。2004年 ; 凯萨武鲁等。, 2012 ; 奥卡诺等。, 2015; 埃克特等。, 2002 ; 布鲁内基等。, 2013 ; 肖沃等。, 1995 ). 鉴于CtCel9A通过金属离子结合（Chauvaux等。, 1995, 1990 )，我们假设Zn的引入²⁺离子可以提高J30的热稳定性。使用CtCel9A晶体结构作为参考模型并比较其Zn的几何形状²⁺-与J30内相应片段的结合位点，我们创造了一种称为J30 CCH的突变体（表示突变的残基身份：A98C类，G114C类和Y143H（H）). 这个晶体结构三个突变体中的一个突变体成功地引入了锌²⁺预期结合部位的离子。我们的圆二色性（CD）和差示扫描荧光法（DSF）数据表明J30的熔化温度成功升高。对酶变体的酶分析表明，催化最佳温度提高了5-10°C。我们的数据支持结构金属离子在促进热稳定性方面的拟议作用（Juy等。, 1992 )并强调了金属引入作为生物量糖化及其他过程中设计强健蛋白质的工具的适用性（布朗纳等。, 1994 ; 保加利亚等。, 2015 ).

2.方法

2.1. 分子生物学、蛋白质表达和纯化

使用QuikChange Lightning Multi-Site-Directed Mutagenesis Kit（安捷伦科技，目录号210515）在DNA水平将A98C、G114C和Y143H突变导入质粒pBIL-J30。

野生型J30（J30 wt）和J30 CCH分别携带C末端多组氨酸标签，于大肠杆菌在含有50 微克毫升⁻¹卡那霉素和2 米M（M）硫酸镁₄在200 转速最小值⁻¹.细菌悬浮液在37°C下培养，然后用0.5 米M（M）OD处的IPTG_600 纳米4（J30 wt）或1（J30 CCH），然后在20°C下。蛋白质表达持续17 h（J30 wt）或19 h（J30 CCH）直到OD_600 纳米达到20（J30 wt）或20.5（J30 CCH）。

细胞在0.15的缓冲液中溶解 M（M）氯化钠，25 米M（M）HEPES pH 7.4，1 米M（M）PMSF使用Avestin乳胶Flex-C3均质机。使用Ala KTAexplorer 100 Air通过镍亲和力（5 ml HisTrap HP或FF）和尺寸排除色谱法（Superdex 200 10/300 GL，均来自GE Healthcare Life Sciences）。用于生产和隔离J30 CCH的所有介质和缓冲液也包含10 µM（M）氯化锌₂.

2.2. 结晶

使用以下筛网对野生型J30进行初始稀疏基质结晶筛选：Berkeley（来自Lawrence Berkeley国家实验室；Pereira等。, 2017 )、Crystal Screen、Index、Natrix、PEG/Ion、PEGRx、SaltRx（全部来自Hampton Research）和MCSG-1（来自Microlysis）（Jancarik&Kim，1991年 ). 他们使用凤凰机器人（Art-Robbins Instruments）进行设置。浓度为12 毫克毫升⁻¹纯化的酶，蛋白质在0.1 M（M）二水柠檬酸三钠，pH 5，15%(w个/v（v）)2-丙醇，10%(w个/v（v）)聚乙二醇10 000.在3 采用坐滴蒸汽扩散法测定了室温下的生长速度。以相同的方式制备了J30 CCH晶体。所有液滴由1个组成 µl蛋白质溶液和0.5 µl储液罐溶液。

2.3. 数据收集和处理

晶体转移了20%(v（v）/v（v）)甘油和液氮闪冷。在斯坦福同步辐射光源（SSRL）、SLAC国家加速器实验室的束线7-1上收集了本地J30数据集，在劳伦斯伯克利国家实验室先进光源（ALS）的伯克利结构生物学中心束线5.0.1上记录了J30 CCH衍射数据。所有数据均使用振荡角测量Δφ1°和ADSC Quantum 315r探测器。

所有数据集都使用-3dii公司中的选项夏2（2010年冬季 ; 卡布施，2010年 ; 埃文斯，2006 ). 阶段划分由执行分子置换使用相位器（麦考伊等。, 2007 )来自菲尼克斯一套程序（亚当斯等。, 2010 ). CtCel9A（PDB条目1个信用证; 31%序列一致性）作为J30 wt的搜索模型（TFZ最高得分为19.7），然后用于生成J30 CCH图。模型改进采用交替的手动建模，使用库特（埃姆斯利等。, 2010 )和自动化结构精细化通过菲尼克斯定义（黄嘌呤等。, 2012 ). 每个数据集中随机选择2000次反射进行交叉验证。后来的迭代包括TLS精细化使用从中获取的TLS组TLSMD公司web服务器（Painter&Merritt，2006一，b条 ). 所有数据收集、阶段划分和细化统计总结见表1。显示结构模型的图形是使用PyMOL公司（v.1.7.2.1；薛定谔）。

表1
数据收集，精细化和模型统计

括号中的值用于外壳。

	J30重量	J30 CCH公司
PDB代码	5小时	5铀2氧化物
数据收集统计
光束线	7-1，SSRL	5.0.1、ALS
波长（Ω）	1.1271	0.9774
晶体到探测器的距离（mm）	200	180
φ收集/Δφ(°)	120/1	180/1
暴露时间（s）	三	1
“空间”组	P（P）6₅22	P（P）6₅22
单位-细胞参数
一，b条，c（c）(Å)	91.06, 91.06, 316.66	90.96, 90.96, 316.32
α，β，γ(°)	90, 90, 120	90, 90, 120
分辨率（Ω）	76.52–1.70 (1.74–1.70)	70.51–1.46 (1.50–1.46)
测量反射	1220921 (79778)	2888558 (210630)
独特的反射	86505 (6276)	134366 (9693)
完整性（%）	100.0 (100.0)	99.8 (99.2)
多重性	14.1 (12.7)	21.5 (21.7)
R（右）_合并†(%)	13.5 (131.3)	13.8 (170.4)
〈我/σ(我)	19.3（2.2）	17.8 (2.3)
科科斯群岛_1/2(%)	99.9 (70.6)	99.9 (71.5)
威尔逊B类系数（Ω²)	15.9	13.4
细化和模型统计
分辨率（Ω）	55.9–1.70 (1.74–1.70)	70.51–1.46 (1.50–1.46)
R（右）_晶体‡(%)	14.09 (23.39)	13.97 (22.81)
R（右）_自由的§(%)	16.57 (25.51)	15.12 (24.98)
分子数量
蛋白质	1	1
水	765	800
柠檬酸盐	1	1
甘油	三	4
锌²⁺	0	1
蛋白质残留物数量	543	543
相对标准偏差。¶
键长（Å）	0.008	0.007
粘结角度（°）	0.981	0.924
冲撞得分	0.23	0.57
平均各向同性B类系数（Ω²)
总体	20.6	19.4
大分子	18	16.6
溶剂	34.8	34
配体	32.3	30.4
拉马钱德兰阴谋
有利地区（%）	98	98
允许的区域（%）	1.6	1.6
异常值（%）	0.18	0.18
旋转器异常值（%）	0.67	0.67

†R（右）_合并= $[\textstyle\sum_{hkl}\sum_}|i_{i}（hkl）-\langle i（hk1）\rangle|/]$ $[\textstyle\sum_{hkl}\sum_{i} 我_{i} （香港）]$ ，其中我_我(香港特别行政区)是反射和〈的单个测量的强度我(香港特别行政区)〉是反射的平均强度。
‡R（右）_晶体= $[\textstyle\sum_{hkl}\big||F_{rm obs}|-|F_}\rm calc}|\big|/]$ $[\textstyle\sum_{hkl}|F_{rm obs}|]$ ，其中F类_{光突发事件}和F类_计算分别是观测和计算的结构系数振幅。
§R（右）_自由的计算为R（右）_晶体使用结构中省略的2000个随机选择的反射精细化。
¶键角和长度的均方根偏差是基于构象依赖文库计算的（Moriarty等。, 2014

, 2016

2.4. 差示扫描荧光法

比较J30 wt和J30 CCH的热稳定性的DSF测定在Applied Biosciences StepOnePlus实时PCR系统上进行，一式三份，在30 µl刻度，含0.5 毫克毫升⁻¹酶，150 米M（M）氯化钠，25 米M（M）HEPES pH值7.4，10 µM（M）氯化锌₂和SYPRO橙色蛋白凝胶染色剂（生命科技，目录号S-6650），5×。在25至99°C温度下记录荧光信号。

锌²⁺-滴定样品由a 1制备 h将J30 CCH与150倍化学计量过量的EDTA pH 7.4孵育并透析18 h对0.15 M（M）氯化钠，25 米M（M）HEPES缓冲液pH 7.4。A 1个毫克毫升⁻¹酶溶液与氯化锌孵育₂在不同浓度下保持30 添加染料前min。如上所述进行DSF测定，最终浓度为0.5 毫克毫升⁻¹J30 CCH，0–10 µM（M）氯化锌₂, 0.15 M（M）氯化钠，25 米M（M）HEPES pH 7.4，SYPRO橙色蛋白凝胶染色5倍。

2.5. 圆二色性

J30 wt和J30 CCH的熔化曲线大肠杆菌使用Jasco J-815 CD光谱仪在20至85°C的温度下记录，使用1 mm试管。检测浓度为0.1 毫克毫升⁻¹酶，150 米M（M）氯化钠，25 米M（M）HEPES pH值7.4，10 µM（M）氯化锌₂。在200–250波长范围内记录了三次累积 nm施加0.2 nm数据间距。

2.6. 酶特异性分析

反应建立在50 µl刻度，使用15 微克毫升⁻¹酶，0.1 M（M）人工编码站pH值6，10 µM（M）氯化锌₂和0.25 米M（M）4-硝基苯基β-D类-吡喃葡萄糖苷(第页NPG；Sigma，目录号N7006），4-硝基苯基β-D类-纤维二糖苷(第页NPC；TCI America，目录号N0867）或4-硝基苯基β-D类-纤维三糖苷(第页NPG3；Carbosynth，目录号EN04796）。阳性对照组的最终浓度为3.6 M（M）NaOH代替酶。阴性对照品含有缓冲液而不是酶，在针对碱性水解进行内部标准化之前减去。将三硅酸盐样品在50°C的Applied Biosciences Veriti 96-Well Thermal Cycler中培养，冷却至4°C，转移至96-Well透明平底板中，并与2%混合(w个/v（v）)体积比为1:1的碳酸钠。入射波长为405时的吸光度 nm在分子器件SpectraMax M2上测量。

2.7. 催化分析

分析条件包括15个微克毫升⁻¹酶，0.3 米M（M） 第页NPC（西格玛，目录号N5759），10 µM（M）氯化锌₂, 31.3 米M（M）柠檬酸盐，根据pH值，4.7–51.1 米M（M）乳酸和28.4–59.4 米M（M）磷酸盐。100 在BioExpress GeneMate IsoFreeze PCR支架上的96个平板上建立三次µl反应，并培养30 应用生物科学Veriti 96-Well Thermal Cyclers中的min。除Beckman Coulter Biomek FX和NX外，样品冷却和传输、反应猝灭和读出步骤如上所述进行^P（P）机器人被用于96周格式的所有液体处理。阴性对照组含有缓冲液而不是酶，并被减去。

3.结果

3.1. J30整体褶皱

这个晶体结构J30的分辨率为1.7 奥比分子置换（表1). 64 kDa酶包含一个由大约80个氨基酸残基组成的N端Ig样结构域和一个C端催化域大约465个氨基酸残基（图1和补充图S1）。底层结合裂隙呈明渠形状。而N端部分内的所有二级结构元件β-链，酶作为一个整体包含大约40%的α-螺旋线和随机线圈。

图1
J30的晶体结构作为卡通形象(一)和没有(b条)蛋白质表面。J30 wt包含一个N-末端Ig样结构域和一个C-末端催化域，这在GH家族9名成员中很常见。催化氨基酸残基Asp147和Glu523的侧链以水蓝色表示。还强调了与介导锌的残基相对应的侧链²⁺三重突变体J30 CCH的协同作用。(一)残基Asp147和Glu523位于活性位点和底物结合通道的中心。(b条)活性部位（红色星号）和Zn²⁺-介绍站点（紫色星号）是彼此相邻的独立站点。在催化域，的(α/α)₆-桶形结构（左下）和四股β-工作表（右下角）被转换为透视图。

Ig样结构域的整体折叠在很大程度上类似于相关结构的折叠，在环区中发现了一些差异。它包含七个β-线分成三组（线1、4和5）和四组（线2、3、6和7），形成两个严格相反的平行线β-表。后一页因Pro74扭结而分叉β-将7绞合成两半。N端位于空腔的末端，靠近催化域。在这两种晶体结构中，柠檬酸根离子占据了GH家族9中J30最接近同源物的空间，包括来自C.热电偶（CtCbhA；PDB条目1输出9)，有额外的上游氨基酸，占八分之一β-接口处的绞线催化域（补充图S1；Pereira等。, 2009; 舒伯特等。2004年; 奥卡诺等。, 2015). 这种链的缺失，以及与之相连的氢键β-线束1和7（J30编号）以及催化域，可能导致J30的耐热性较低。类Ig结构域与催化域通过疏水性相互作用、Asp47和Lys510之间的盐桥以及Glu4和Arg431、Ile8和Arg447、Asp42和Asn395、Ala44和Ala509、Asp40和Tyr397、His51和Gly396和Arg398之间的七个氢键来稳定。它们的相对排列与其他具有类Ig结构域的GH家族9成员类似，如LC-CelG、AaCel9A和CtCel9A（Okano等。, 2015; 佩雷拉等。, 2009).

The predominant architectural element of the催化域是一个(α/α)₆-筒体结构由12个α-GH家族9（Juy等。, 1992)以及其他家庭（帕西格拉等。, 1998 ). 枪管建在一个六平行的内环上α-螺旋（2、6、8、11、13和18；图1中顺时针排列)外圈六个α-相反方向的螺旋（5、7、9、12、14和1）。外螺旋相对于内螺旋倾斜一定角度。虽然筒形螺旋之间的一些环包含随机线圈的延伸部分以及额外的二级结构特征，但任何内螺旋与其相邻外螺旋之间的环大多较短（在6/7、8/9、11/12和13/14对之间；补充图S1）。这是典型的(α/α)₆-桶，圆圈与最多的C端子闭合α-螺旋18相邻α-螺旋线1。α-螺旋线10可以被视为α-螺旋线9，螺旋线仅由Phe339引起的扭结分开。在催化域，桶形螺旋线之间的延伸段包含五个附加段α-螺旋，一个3₁₀-螺旋和六个短β-形成两个单独片材的股线。除了螺旋(α/α)₆-桶，α-螺旋17是唯一的保守螺旋。

基板结合通道从内筒螺旋线N端附近的区域（对应于结合基板的非还原端所在的位置）向J30的非结构化部分延伸，J30的大部分两侧是随机线圈（图1). 它以相对于桶结构的角度运行，最接近桶螺旋13和18处的二级结构元素以及保守的α-螺旋17。预计将直接结合底物或催化反应的大多数残基位于酶的随机螺旋部分，只有Tyr151(α-二级结构元件上发现的螺旋2）、Arg469（15）、Tyr519（17）和Tyr528（18）（补充图S1）。上面列出的许多二级结构元素似乎在与底物直接相互作用的残留物后面提供了支架。

3.2. 三重突变体J30 CCH的结构

这个晶体结构J30 CCH的分辨率为1.46 Å. 电子密度与锌的存在一致²⁺预测位置的离子（图2b条). 金属配位由Cys98、Cys114、His115和His143的侧链介导，有效取代野生型酶中His115与Tyr143形成的一个氢键（图2一). GH家族9个结构中含有同源Zn²⁺-结合位点，CtCel9A，AaCel9A（Pereira等。, 2009)，Cel9M来自纤维素梭菌（PDB条目国际原子能机构协会; 帕西格拉等。, 2002 )和CelTC.热电偶（PDB条目2亿; 凯萨武鲁等。, 2012)共享相同的模式螯合作用，而LC-CelG的天冬氨酸残基位于J30 CCH的Cys114（补充图S1；Okano等。, 2015). 一般来说，组氨酸、酸性侧链，特别是半胱氨酸侧链是结构锌的常见配体²⁺离子（Pace&Weerapana，2014 ). 而CtCbhA在酪氨酸侧链和组氨酸残基之间含有氢键，类似于J30（Schubot等。2004年)，一些GH家族9成员，包括来自短脊周氏菌（PDB条目4zg8型)，丝氨酸起组氨酸的作用（Arimori等。, 2013 ; 沙功等。, 1997 ; 曼德尔曼等。, 2003 ; 佩特昆等。, 2015 ). 其他结构完全缺乏氢键，因为苯丙氨酸取代了酪氨酸（Khademi等。, 2002 ; 布鲁内基等。，2013年)或者有不同的脊椎褶皱，如PpGlcNase（本田等。, 2016)和几丁质酶副溶血性弧菌.锌²⁺离子距离为14 从活性位点中心向与结合底物还原端相对应的方向移动。主干C、N和C之间的平方根偏差^α野生型和三重突变酶的晶体结构的原子数为0.094 Å,即它们实际上是相同的。在晶体结构我们观察到J30 CCH的平均各向同性较低B类比中的晶体结构J30 wt（表1). 邻近残基98、114和143的残基的局部原子位移参数显示出类似的趋势，表明通过引入Zn使突变位点稳定²⁺离子。

图2
锌²⁺-J30 wt和J30 CCH晶体结构中的引入位点。(一)在J30 wt中，氢键连接His115和Tyr143的侧链。在不干扰的情况下，H^α三Gly114和Ala98的侧链指向他们。(b条)晶体结构J30 CCH的基因显示成功的残基突变和Zn²⁺合并。金属离子通过Cys98的侧链配位（2.3 距离），Cys114（2.4 欧）、His115和His143（均为2.1 Å).

3.3. 底物结合和催化模式

由于保留了最突出的二级结构元素和关键残基，提出了J30与底物结合的潜在细节问题。我们叠加了J30 wt和非活性CtCbhA突变体E795Q的晶体结构，该突变体与纤维四糖（PDB入口）共结晶1季度5; 舒伯特等。2004年)，试图将配体模拟为J30的活性位点（图3). J30的Glu523对应于CtCbhA的Glu795（补充图S1）。

图3
来自CtCbhA突变体E795Q（PDB入口）的纤维四糖分子1季度5)适合于J30 wt晶体结构的活性部位。根据其相对于糖苷键的相对位置，单个环标记为+2至-2，糖苷键将被Asp147和Glu523侧链的作用裂解（标记为红色）。破折号表示水解水分子（红色球体）亲核攻击中直接涉及的氢键。工程锌²⁺站点位于右下角，用灰色标签显示。剩余标签字体大小反映了与查看器的接近程度。

Asp147和Glu523高度保守的酸性侧链直接参与酶催化。Glu523起到质子供体的作用，而Asp147使所描述的水分子脱质子，以进行亲核攻击（Davies&Henrissat，1995）). 该模型与反转后GH家族9成员一致反应机理关于处于−1位置的环的异丙基C原子，Asp147和Glu523从相反的侧面与底物相互作用。亲核攻击由涉及高度保守的Asp144和适度保守的Tyr151的氢键网络辅助。这种排列与AaCel9A（Pereira等。, 2009)与纤维素酶E4中描述良好的几何结构相似褐孢热单孢菌（萨肯等。, 1997; 图3).

+1位置的碳水化合物环堆叠在Trp226和Tyr519的侧链之间。所有具有溶解结构的GH9家族成员在这些位置都含有芳香族残基。该环通过涉及His467和Arg469的氢键进一步固定在适当位置，这两个氢键在相同的结构中高度保守，除了与之关系不太密切的PpGlcNase和几丁质酶副溶血性弧菌。通过氢键（Tyr306和Trp352）或环堆积（Trp408）与-1和-2位置的环相互作用的Tyr304、Trp351和Trp409也发现了相同的保守模式。后一残基的侧链通过与Tyr528的适度保守氢键稳定。Gly304的主链N原子和-1位置的碳水化合物部分之间的氢键仅在J30及其最接近的同系物LC-CelG、CtCel9A、AaCel9A和CtCbhA之间共享。

图2和3共同说明了锌的分离²⁺-活性位点的引入位点是His143侧链指向Asp144和Asp147相反方向的结果。由于His143侧链的取向与J30 wt中的Tyr143类似，金属离子结合对催化活性酶的活性是意料之外的。相反，含有His143、Asp144和Asp147的无规螺旋段的稳定可以通过三重突变和Zn的引入来解释²⁺通过金属离子连接含有Ala98、Gly114和His115以及Tyr143的三个环。

3.4. 金属引入对J30耐热性的影响

在差示扫描荧光分析中，酶变体的展开方式不同（图4一). 基于曲线的拐点T型_米J30 CCH（70.1℃）比野生型酶（58.9℃）高11.2℃。这种增加是由于锌的存在²⁺通过使用EDTA去除离子证实了这一点，这减少了T型_米与J30 wt相同水平的三重突变体（图4b条). 将离子再导入J30 CCH中可完全恢复酶的耐热性。CD熔化曲线支持这些观察结果（图4c（c）). 208和222处的局部极小值 nm典型值α-螺旋含量与催化域。其振幅随温度升高而降低可能反映出催化域。根据DSF数据，J30 CCH突变体具有适度的5 µM（M）锌亲和力²⁺（图4b条; 科钦奇克等。, 2015 ). 然而，锌的掺入²⁺离子仍然可以稳定蛋白质，并导致野生型和突变型酶之间的耐热性差异。

图4
与野生型酶和锌相比，J30 CCH表现出更强的耐热性²⁺-剥离J30 CCH。(一，b条)差示扫描荧光法。显示了三元组的标准误差。(一)锌的引入²⁺增加了计算值T型_米11.2°C。(b条)J30 CCH与EDTA孵育后的耐热性与野生型酶相当，但通过添加锌可以恢复耐热性²⁺(c（c）)圆二色性。三重突变体的二级结构元件比J30 wt的元件承受的温度要高得多。

3.5. J30 wt和J30 CCH的酶特异性

据报道，J30可水解纤维三糖类似物第页NPC，但不是纤维二糖类似物第页NPG（格拉登等。, 2014)，之前的酶研究已经揭示了AaCel9A（Eckert等。, 2002, 2009 ). 我们检测了J30 wt和J30 CCH对含有一个、两个或三个糖基的4-硝基苯基葡萄糖苷的底物特异性，并比较了游离第页-硝基酚酸盐(第页NP），底物水解3.6 M（M）NaOH（代表100%；图5). 这两种变体在三种测试底物上具有相同的活性，证实了先前的结果，并且与AaCel9A类似：它们不能水解第页NPG和产生更多可检测性第页NP来自第页NPC比来自纤维四糖类似物第页NPG3。而三重突变体产生稍多第页NP来自第页NPG3比野生型酶在50°C时更容易水解第页NPG3到纤维二糖和不可清洗第页NPG对纤维三糖和第页NP，从而与AaCel9A（Eckert等。, 2002).

图5
酶底物比较。J30 wt和J30 CCH在选定的葡萄糖苷衍生物上遵循不同的活性模式。吸光度第页NP反映其水解β-一个葡萄糖苷(第页NPG），两个(第页NPC）或三个(第页NPG3）葡萄糖部分。100%指使用3.6的阳性对照 M（M）氢氧化钠。

3.6. J30 wt和J30 CCH的催化剖面

酶催化，特别是水解反应中的产物形成速率内在地取决于温度和pH。使用第页NPC作为基底（图6). 这两种酶变体在pH 6左右都表现出催化最佳，这与反应机理。锌的掺入²⁺离子提高了J30的最佳温度第页NPC的周转率为5-10°C，其对催化的影响只是物理上的，而不是化学上的。DSF和CD数据证实了这些发现，并与之前野生型J30酶（Gladden等。, 2014).

图6
酶分析。热耐受性的增加与J30 wt和J30 CCH的催化曲线的变化平行。这个第页这两种酶变体的NPC周转率根据反应温度和pH绘制，显示最佳温度增加（等高线间距0.05）。每个数据点一式三份由一个菱形表示，菱形的大小与其标准误差相对应。

4.结论

钙的积极作用²⁺纤维素酶CtCel9A的耐热性与锌的相关性已在前面展示过²⁺-将站点与绑定酶活性和结构完整性（Chauvaux等。, 1990, 1995). 我们基于结构数据设计的J30突变版本进一步强调了这种关系。这里，稳定性增加的大部分可能是由于His115和Tyr143侧链（J30 wt）之间的氢键与Zn之间的四个配位键的净交换所致²⁺Cys98、Cys114、His115和His143的离子和侧链（J30 CCH；图2). 这种稳定可能部分来自多肽链的三个独立部分相互作用通过锌²⁺离子。结构和生物化学数据强烈表明，金属结合位点是纯结构的，但它也接近活性位点残基Asp144和Asp147以及还原端结合的底物间隙区域。

与最接近的同源物相比，J30不含结合钙²⁺离子。三钙²⁺-在CtCel9A中发现了结合位点，其中两个结合位点以不同的组合存在于AaCel9A、CtCbhA和LC-CelG中。加利福尼亚州的两个²⁺在具有与J30不同的主链几何形状的环区中发现位点，对应于J30残基175–198和471–475（Juy等。, 1992). 第三个位点位于保守的主干褶皱区域，在所有四个同源物的晶体结构中都可以找到；在肖沃语中称为“B”等。(1995). 在J30中，Lys308的侧链氨基与Gly353 O原子以及Glu313和Glu314羧基在完全相同的位置形成氢键。因此，引入Ca²⁺通过该区域的点突变进入J30的离子可能与锌的作用方式类似²⁺例如，但在其他两个站点的情况下可能需要环路重塑。

与引入二硫键以交联多肽链中连接更松散的部分不同，我们的方法不限于分泌蛋白。我们利用了锌²⁺-在目标酶的同系物中发现了结合位点，从而提高了酶的热稳定性和最适温度。在更广泛的背景下，这一战略很可能在未来被证明是有前途的：从头开始将金属离子结合引入蛋白质。当没有可作为参考的金属离子结合同系物时，这种方法无疑更具挑战性。特别是，最近的研究表明，需要考虑的交互网络不仅仅是要设计的直接站点的几何结构（Guffy等。, 2016 ). 然而，在过去十年中，蛋白质重新设计的计算方法有了很大改进（西蒙斯等。, 1999 ; 黄等。，2016年 )，并能创造出对医学和生物技术应用有用的热和化学性质更稳定的蛋白质。J30耐热性和最佳催化温度的提高解决了生物质能解构的瓶颈问题。在生物燃料生产的这一步中，酶的稳定性直接转化为最终产品的成本（布兰奇等。, 2011 ).

支持信息

3D视图

PDB参考：野生型J30，5u0h;J30 CCH，5u2o

补充图S1。内政部：https://doi.org/10.107/S2059798318006678/yt5103sup1.pdf

致谢

我们感谢劳伦斯·伯克利国家实验室先进光源伯克利结构生物学中心的工作人员。我们感谢Jed Lynn和John Gladden的建议和协作精神，感谢Jeffrey Kimbrel为编程语言R提供的专家帮助。作者声明，他们与本文的内容没有利益冲突。

资金筹措信息

这项工作是美国能源部联合生物能源研究所的一部分(https://www.jbei.org)通过劳伦斯伯克利国家实验室和美国能源部签订的合同DE-AC02-05CH11231，获得美国能源部、科学办公室、生物与环境研究办公室的支持。伯克利结构生物学中心部分由美国国立卫生研究院支持，国家普通医学科学研究所。高级光源由美国能源部基础能源科学办公室科学办公室主任根据合同DE-AC02-05CH11231提供支持。SLAC国家加速器实验室斯坦福同步辐射光源的使用得到了美国能源部科学办公室基础能源科学办公室的支持，合同号为DE-AC02-76SF00515。SSRL结构分子生物学项目由DOE生物与环境研究办公室和国家卫生研究院、国家普通医学科学研究所（包括P41GM103393）支持。

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