Anaerobic fixed-target serial crystallography using sandwiched silicon nitride membranes

Bjelčić, M.; Sigfridsson Clauss, K.G.V.; Aurelius, O.; Milas, M.; Nan, J.; Ursby, T.

doi:10.1107/S205979832300880X

研究论文

结构
生物学

国际标准编号：2059-7983

第79卷| 第11部分| 2023年11月| 第1018-1025页

https://doi.org/10.107/S205979832300880X

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三明治氮化硅膜厌氧固定靶连续晶体学

莫妮卡·比杰尔奇奇,^一 ^* Kajsa G.V.Sigfridsson克劳斯,^一奥斯卡·奥雷利乌斯,^一米尔科·米拉斯,^一杰南 ^一和托马斯·厄斯比 ^a、，^b条 ^*

^一瑞典隆德SE-221 00隆德，隆德大学MAX IV实验室，邮政信箱118^b条瑞典隆德LINXS高级中子和X射线科学研究所
^*通信电子邮件：莫妮卡.bjelcic@maxiv.luse,托马斯.ursby@maxiv.luse

M.Schiltz编辑，卢森堡Recherche国家基金会(收到日期：2023年7月20日； 2023年10月5日接受)

近年来，串行晶体学的出现，最初是在X射线自由电子激光器（XFEL）上率先出现的，引发了人们在室温下收集大分子晶体学数据的兴趣。已经开发了各种固定目标串行晶体学技术，从商用芯片到在不同同步加速器设施上实现的内部设计。然而，目前还没有专门设计用于直接处理氧敏感样品的商用芯片（作者已知）。本研究提出了一种采用“三明治”结构排列的氮化硅芯片的方法，能够从氧敏感样品中可靠地收集室温数据。该方法涉及使用定制的3D绘制装配工具和MX样品架。为了验证所提出方法的有效性，使用BioMAX X射线大分子晶体成像光束线、Balder X射线吸收光谱光束线和紫外-可见吸收光谱对脱氧血红蛋白和高铁血红蛋白样品进行了研究。

关键词：固定靶连续晶体学;样品支架;夹层氮化硅膜;厌氧数据采集;血红蛋白.

PDB参考：高铁血红蛋白，8puq;右旋血红蛋白，8pur

类似文章

1.简介

串行同步加速器晶体学（SSX）正在迅速成为低剂量、室温结构生物学研究的一种流行方法（Stellato等。, 2014 ; 加蒂等。, 2014 ; Coe&Fromme，2016年 ; Diederichs&Wang，2017年 ). 第四代储存环光源的发展（埃里克森等。, 2014 )已启用高X射线束光辉微米级聚焦；结合快速帧速率X射线探测器的进步（Leonarski等。, 2020 )，用户现在可以使用专用SSX波束线终端。目前SSX的取样方法大致可分为两类：固定靶方法，即将晶体浆液沉积在穿过光束的光栅衬底上（Sherrell等。, 2015 , 2022 ; 舒尔茨等。, 2018 ; 泽林斯基等。, 2022 )和流动系统，悬浮在介质中的晶体直接通过光束（博塔等。, 2015 ; 希洛瓦等。, 2020 ; 2020年，南 ; 克诺什卡等。, 2020 ; 高希等。, 2023 ). 然而，从使用的样品数量到系统的加热、毛细血管的堵塞、材料的燃烧和样品的灵敏度，挑战依然存在。有特殊需要的一种样品类型是金属蛋白，可以估计金属蛋白占蛋白质组的很大一部分。厌氧样品环境扩大了氧化还原化学的范围，可通过晶体学方法进行表征，并用于研究氧化还原活性金属蛋白（Handing等。, 2018 ). 然而，对厌氧性的要求增加了另一层挑战，并提出了不同的解决方案，包括在样品位置周围使用环境室（Fuller等。, 2017 ; 梅赫拉比等。, 2021 )或在厌氧条件下密封固定目标芯片（Rabe等。, 2020 ).

血红蛋白（Hb）是一种含铁的血红素蛋白，对氧气运输至关重要。该蛋白由四个球状亚基组成，每个亚基含有血红素B（原卟啉IX组；夏，1998 ). 马血红蛋白是第一个以高分辨率解决的蛋白质结构（Perutz等。, 1960 ). 它是一个有用的氧敏感金属蛋白模型系统，因为它的普遍性和对氧的高但可逆的亲和力。脱氧血红蛋白（DeoxyHb）在亚铁血红素铁（由四个血红素氮和一个组氨酸组成）的配位球中缺少第六个配体，因此对氧的存在非常敏感，而氧血红蛋白（OxyHb）有一个O₂与亚铁血红素铁结合的分子，以及血红蛋白的氧化形式高铁血红蛋白（MetHb），具有一种血红素铁质，它位于+3（铁）中氧化状态在第六配体位置有水结合（Yang和Phillips，1996 ). 这里使用脱氧血红蛋白和甲血红蛋白作为我们厌氧系统的概念证明。

在这里，我们描述了一种在室温下用氮化硅膜进行厌氧SSX的方法，该方法可以很容易地在另一束线上实现。我们开发了一种固定靶点方法，在氮化硅（SiN）芯片（Coquelle）之间“三明治”氧敏感晶体等。, 2015 ; 希洛瓦等。, 2020)保护它们免受环境氧气的影响。使用脱氧血红蛋白晶体，我们证明了厌氧SSX设计的实用性，并使用UV–Vis和X射线光谱学血红蛋白晶体保持在脱氧状态。

2.材料和方法

2.1、。制备微晶

马血红蛋白（Sigma，CAS 9047-09-0）储备液，20–25 毫克毫升⁻¹10年准备米M（M）HEPES pH值7.5，并使用搅拌分批法结晶（Sato-Tomita和Shibayama，2017年 )在沉淀溶液中混合[26%(v（v）/v（v）)销钉3350，10 米M（M）HEPES pH值7.5]。20°C，500 将µl沉淀剂添加至250 µl蛋白质溶液。使用米粒大小的搅拌棒在磁力搅拌器上将混合物在小型HPLC小瓶中搅拌约20 h、之后是5×5×5的晶体获得了微米大小。

2.2. 3D涂漆支架和配件

由于这种芯片尺寸小、厚度薄，处理起来很有挑战性，我们设计了一个组装工具、芯片托盘和MX样品架，以便于操作。MX样品架使用Tough 1500 Resin（美国Formlabs）印刷，而其余3D印刷组件则使用Tough-Resin V5（美国Formlabs）。组装工具经历了几次迭代，如中所示补充图S1最后一次迭代说明了芯片尺寸的缺陷（一些边更长或边缘有“角”），避免了杠杆压力过高，从而破坏芯片，并在组装时留下一个易于操作的角（图1一). 使用芯片托盘（图1b条)，可以准备几个芯片，以便更快地组装。为了便于在MX光束线处将样品安装到测角头上，MX样品架设计为易于连接到脊椎底座（Cipriani等。, 2006 ; 图1c（c）). 拧紧螺钉允许在数据采集期间向夹心芯片的侧面施加额外压力，从而进一步确保密封性。

图1
用于SiN芯片处理的3D涂漆配件。(一)装配工具；(b条)氮化硅芯片托盘；(c（c）)MX样品架。

2.3. X射线晶体学厌氧芯片组件

在收集数据之前，脱氧血红蛋白晶体是在充氮手套箱内新鲜制备的（Coy实验室产品）。手套箱中的平均氧气浓度为2 样品制备过程中的下午，且从未超过10点 p.p.m.。将需氧生长的血红蛋白微晶转移到手套箱中，并通过混合连二亚硫酸钠溶液进行化学还原[50 米M（M）26%连二硫酸钠(w个/v（v）)聚乙二醇3350，10 米M（M）HEPES pH值7.5]（沃伊特·乔夫斯克等。, 1999 )血红蛋白微晶（5和20 µl），并在手套箱内室温下培养2 h（在此期间，结晶浆液会从棕色变为粉红色）。手套箱内，SiN芯片（薄膜尺寸2.5×2.5 mm，膜厚1000 nm，帧尺寸5.0×5.0 mm，框架厚度200 微米；将Silson，United Kingdom）加载到装配工具上（图2一和2b条)，然后添加2 µl微晶浆料（图2c（c）). 为了密封芯片，用小画笔上的一根头发将少量强力胶（Loctite Super Glue Brush On）以L形涂抹在芯片框架的所有四个角上（图2d日). 然后在顶部放置第二块芯片（图2e（电子）)并用杠杆轻轻按压（图2（f）)固定它并形成一个密封，正如沿着所有边缘溢出的少量胶水所证实的那样。然后将组装好的芯片放在MX样品架中（图1c（c）)用于数据收集。

图2
厌氧芯片组装程序。(一)带排屑盘的装配工具。(b条)第一个芯片加载到装配工具中。(c（c）) 2 将µl样品浆液轻轻加载到芯片上。(d日)在芯片的四个角上都滴上一小滴强力胶。(e（电子）)第二块芯片放在上面，形成一个密封的芯片三明治。(（f）)用装配工具的杠杆轻轻按压芯片，以固定它们之间的密封。

2.4. 用于UV-Vis和X射线吸收近边缘结构（XANES）的厌氧芯片组装

XANES实验的目的是建立一个时间戳，以确定芯片能够保留脱氧血红蛋白形态的时间。设计了一个特殊的夹持器，用于将六个芯片三明治放入束线样品环境设置中(补充图S2b条和S2c（c）). 芯片的组装方式与第2.3节所述相同.

使用MX样品架进行紫外-可见光谱分析，芯片的制备方法与X射线晶体数据采集方法完全相同，使用Agilent Cary 60紫外-可视分光光度计在300–800波长范围内进行 nm，随后超过2 h.紫外-可见分光光度计由一根外部光缆改装而成，该光缆带有一个探针，可通向一个带有MX样品架支架的黑匣子。

2.5. 数据收集

2.5.1. 晶体学数据收集

在BioMAX光束线（Ursby）上收集MetHb和DeoxyHb的数据等。, 2020 ). 准备好的芯片三明治(补充图S2一)安装在测角仪上并对齐。使用MXCuBE公司3光束线控制软件（米勒等。, 2017 ). 芯片通过X射线束以规则的蛇形图案进行光栅化，蛇形图案由年在芯片上绘制的网格定义MXCuBE公司3.快速快门在网格的每一行中打开。在数据采集期间，测角仪的旋转被阻止。在室温下收集衍射数据，X射线束尺寸为20×5 µm（半最大全宽），通过10 μm直径孔径，光子能量为12.6 keV和a通量共2×10¹² 光子秒⁻¹. 10 000–20 每个芯片收集了5000张MetHb和DeoxyHb芯片的图像。晶体学数据采集过程被分成几个间隔开的较小网格扫描。因此，不是收集10个 000–20 000张图像，通过几次较小的网格扫描获得。使用曝光时间为0.011的EIGER 16M混合像素探测器记录衍射数据 s.每个晶体接受的平均辐射剂量为～40 kGy，使用放射性-3D（泽尔丁等。，2013年 ). 对于脱氧血红蛋白样品，需要5-10分钟 min从手套箱中取出样本，将其放入光束线槽中并进行数据收集。

2.5.2. XANES数据收集

使用硅漂移探测器（SDD；X-PIPS 7元件SDD，美国Mirion Technologies）在MAX IV实验室的Balder光束线上以荧光模式收集XANES数据。液氮冷却双晶（Si111）单色仪（英国牛津FMB）校准至7112 eV表示Fe的铁箔的第一个拐点 K（K）-边缘数据采集。铁的XANES光谱 K（K）边缘被记录为连续扫描（设置：每个点10的采集时间 ms，能量阶跃0.2 eV，范围7062–7212 电子伏，23 每次扫描s）来调查氧化状态SiN芯片中血红蛋白的血红素铁。第一个芯片用于寻找和聚焦光束；在此之后，每个芯片被采集一次（每个采集包括按直接顺序执行的五次扫描），时间间隔为20 芯片之间的最小值。除了含有脱氧血红蛋白晶体的芯片外，一个完全氧化的晶体样品（脱氧血红蛋白样品暴露在空气中3 min）进行测量。最佳测量策略是散焦光束（0.2×2 mm）带锰过滤器(Z轴−1）荧光检测器前面。传入的通量样本为3×10¹² 光子秒⁻¹.使用给定的通量和束流参数，估计剂量约为67 每次扫描kGy（23 s） ●●●●。为了获得图中所示的归一化XANES光谱，将荧光计数除以10（电离室读取输入通量），并归一化为单位边缘步长。

2.6. 数据处理、建模和细化

衍射数据被索引、整合、合并并转换为MTZ格式，使用CrystFEL公司0.10.1（白色，2019年 ; 白色等。, 2012 ). MetHb和DeoxyHb的指数化率分别为43.3%和53.6%。数据截断、阶段化和结构精炼在中执行中央处理器4云（Krissinel等。, 2022 ; 阿吉雷等。, 2023 ). 脱氧血红蛋白的高分辨率结构（PDB入口伊贝; 威尔逊等。1996年 )和MetHb（PDB条目6sva; 米科拉耶克等。, 2023 )被用作模型分子置换具有相位器（麦考伊等。, 2007 ). 通过一轮刚体对结构进行了改进精炼使用雷夫马克5（尼科尔斯等。, 2018 ; 穆尔舒多夫等。, 1997 , 2011 )然后是几轮有节制的精致。模型构建于库特（埃姆斯利等。, 2010 ; Krissinel&Henrick，2004年 )所有结构表示都是在中生成的PyMOL公司（薛定谔）。MetHb和DeoxyHb的室温SSX结构分别在1.95和1.85获得分别为？分辨率。数据收集和细化统计如表1所示脱氧血红蛋白芯片也分别进行了处理和精炼，以单独进行研究（数据收集和细化统计在中介绍补充表S1).

表1
数据收集和精炼统计学

括号中的值表示最高分辨率外壳。

	甲基血红蛋白	脱氧血红蛋白
PDB代码	8磅	8磅
数据收集
衍射光源	BioMAX、MAX IV实验室	BioMAX、MAX IV实验室
波长（Ω）	0.9763	0.9763
温度（K）	294	294
“空间”组	C121	C121
一,b条,c（c）(Å)	108.29、63.06、54.75	108.29, 63.06, 54.75
α,β,γ(°)	90, 111, 90	90, 111, 90
分辨率（Ω）	53.55–1.95 (2.02–1.95)	53.50–1.85 (1.91–1.85)
R（右）_分裂†(%)	7.50 (41.94)	6.71 (22.28)
〈我/σ(我)	10.60 (1.37)	12.48 (2.90)
科科斯群岛_1/2	0.9903 (0.7593)	0.9914 (0.9049)
完整性（%）	100 (100)	100 (100)
多重性	176 (114)	205 (115)
收集的图像	97424	149207
索引模式	42148	80035
指数化率（%）	43.3	53.6
反射次数	4447049	6070870
独特反射次数	25258	29515
精炼
分辨率范围（Ω）	53.49–1.95	53.50–1.85
R（右）_工作/R（右）_自由的(%)	12.52/17.41	12.99/16.22
原子数	4644	4609
平均值B类系数（Ω²)	66	74
R.m.s.d.，粘结长度（Ω）	0.016	0.015
R.m.s.d.，角度（°）	1.97	1.99

†R（右）_分裂= $[（1/｛\sqrt 2｝）[（\textstyle\sum_｛hkl｝| I_｛\rm even｝-I_｛\rm odd｝|）/0.5\textstyle\sum_｛hkl｝（I_｛\rm even｝+I_｛\rm odd｝）]。]$

3.结果

3.1. 脱氧和金属氧化物形式之间的结构差异

这个α-脱氧血红蛋白的亚单位在血红素袋中约有3个水分子 Å（3.1 从铁和氢结合到远端组氨酸（图3). 在MetHb中α-和β-血红素基团有一个水分子作为第六配体，约为2 Å (2.2 从铁（图4）). 当血红蛋白从脱氧形式转变为氧或金属形式时α1β1/α2β2二聚体。二聚体的外部区域和二聚体界面区域出现可见变化。之间的相互作用α1β2和α2β1向分子中心移动。接触中的残留物αβ接口介于αB（Glu30/A–Phe36/A）和βH（Phe122/B–Lys132/B），αG（Ser102/A–Leu113/A）和βG（Gly107/B–Phe118/B），以及αH（Phe117/A–Lys127/A）和βB（Arg30/B–Pro36/B）。最引人注目的运动是在β-血红素，其中与空的相比，水分子结合在MetHb中β-脱氧血红蛋白中的血红素。这个β-MetHb的血红素向下移动到血红素袋的近侧(补充图S3). 两种结构均与已发表的结构一致（Baldwin&Chothia，1979 ; 利丁顿等。, 1992 ; 威尔逊等。1996年).

图3
最终2视图毫发_o个−DF公司_c（c）脱氧血红蛋白血红素口袋的电子密度图：(一)的α亚单位和(b条)的β亚单位。密度轮廓为1.1σHis58/63和血红素铁之间的距离是4.2 而水分子和血红素铁之间的距离是3.1 Å

图4
最终2视图毫发_o个−DF公司_c（c）MetHb血红素口袋的电子密度图：(一)的α亚单位和(b条)的β亚单位。密度轮廓为1.1σHis58/63与血红素铁之间的距离为4.1 而水分子和血红素铁之间的距离是2.1 Å

同样经过独立处理的五块含有脱氧血红蛋白的芯片都显示出脱氧状态(补充表S1和补充图S12–S15)除芯片3在制备后含有气泡外，导致用于单独分析的索引图像太少。

3.2. XANES数据

通过在Balder光束线上用X射线束对芯片三明治进行初步测试，我们了解到 K（K）长时间曝光后边缘偏移（60 s） ●●●●。铁的位置 K（K）边缘在第一次扫描后移动到更高的能量（30 s）在第二次XANES扫描时，边缘已经接近完全氧化血红蛋白的位置。这一事实被用于一种策略，通过等待20 开始扫描每个连续的薯片三明治之间的间隔分钟，即只比较每个芯片的第一次扫描（10 s到达边缘，23 s全扫描）。XANES为Balder光束线制造的芯片支架中安装的六个单独芯片三明治的数据显示，测量开始时，其中两个芯片三明治（芯片3和4）的密封完好(即仍处于脱氧状态；补充图S4)，因为它们的吸收边没有移动到O上观察到的更高能量₂结合。这给了我们一个至少40英镑的时间戳 min（芯片2和芯片4的扫描1开始之间的时间）。图5显示了芯片4在第一次扫描和第二次扫描时的边缘位置分别与脱氧和氧化状态的比较。通过比较得出的结论是，只有芯片4的第一次扫描（黑色虚线）具有与血红蛋白脱氧状态相对应的边缘位置（蓝线），而第二次扫描（灰色虚线）已经移动到氧合状态的位置（红线）。

图5
铁 K（K）-与SiN芯片4中的晶体相比，处于脱氧状态（蓝色，单扫描）和完全氧化状态（红色）的血红蛋白晶体的边缘XANES：第一次扫描（黑色虚线）和第二次扫描（灰色虚线）。插图，主图中用灰色矩形标记的区域的边缘位置的特写视图。

3.3、。紫外线-可见光数据

按照第2.3节所述准备芯片。两个芯片中的样品都保持粉红色，在前30个芯片中，没有一个芯片从脱氧变为金属形态最小值根据光谱（图6和补充图S11). 第二块芯片也进行了测量1 小时30 最小值和2 小时10 实验开始后min(补充图S11). 随后的时间点显示了脱氧形式的变化，当样品颜色从粉红色变为棕色时，也可以肉眼看到脱氧形式。

图6
MX样品架中含有脱氧血红蛋白的芯片三明治（芯片1）的紫外-可见光谱（光谱在原产地2018年b）。

4.讨论

如XANES、UV–Vis吸收光谱和X射线结晶学实验的组合所示，所述方法将血红蛋白的再氧化速度减缓到允许在合理的时间范围内收集氧敏感样品的数据的水平。XANES数据显示血红蛋白晶体以脱氧形式存在至少40年最小值（见图5和补充图S4). 边缘扫描数据显示，Balder夹持器中的芯片三明治成功率相对较低，这主要归因于多芯片夹持器的设计。具体而言，中行位置（芯片3和4）通过双螺杆机构承受来自SiN芯片两侧的压力，如所示补充图S2相反，支架的上下两排仅从一侧（一个螺钉）向芯片施加压力。SiN密封件上的这种非对称压力分布似乎导致泄漏（芯片2、5和6）或更容易断裂。值得注意的是，只有芯片3和4成功地保存了脱氧形式。根据这些观察结果，开发了一种新的晶体采集支架，以在单个芯片的所有四个侧面上保持均匀的压力，如图1所示(c（c）). 新设计的MX样品架的可行性通过紫外-可见光谱分析得到确认，这表明脱氧状态持续保持超过30 最小值（图6和补充图S11). 为了确定方法的一致性，从总共五个芯片中收集了晶体数据，所有提供足够完整数据的四个芯片都显示存在脱氧状态(补充表S1和补充图S12–S15). 根据XANES的数据，很明显X射线照射会导致铁边移动到更高的能量，尽管尚不清楚这是因为芯片密封断裂还是由于其他一些影响。观察到边缘偏移的原因可能是O的结合₂到亚铁（OxyHb）或铁氧化到铁状态（MetHb）。第一次XANES扫描和晶体学测量的剂量相似（70和40 kGy），两者均显示存在脱氧形式。该剂量低于最近确定的SSX实验安全剂量（约380 千吉；德拉莫拉等。, 2020 )虽然溶菌酶就是这样，但我们已经研究了一种血红素蛋白，它可能对辐射损伤更敏感。建议保持低剂量并独立验证氧化状态如果可能的话，通过光谱分析，因为其他样品可能对X射线辐射有不同的灵敏度。

用于芯片夹层制备的组装工具简化了工艺，便于可视化，并降低了晶体或芯片损坏的风险。所示工具的CAD模型可在支持信息此外，氮化硅芯片不会引起强烈衍射，从而损坏探测器，但只能一次性使用。使用MX样品架和提出的协议，从氧敏感样品中收集数据是可行的，并且该方法可以在许多MX光束线上实现，这些光束线可以访问手套箱和MX兼容测角仪。

支持信息

3D视图

PDB参考：高铁血红蛋白，8puq;右旋血红蛋白，8pur

3D打印数据：组装工具1。内政部：https://doi.org/10.1107/S205979832300880X/tz5111sup1.bin

3D打印数据：装配工具2。内政部：https://doi.org/10.107/S205979832300880X/tz5111sup2.bin

3D打印数据：芯片托盘。内政部：https://doi.org/10.107/S205979832300880X/tz5111sup3.bin

3D打印数据：手动调节器。内政部：https://doi.org/10.107/S205979832300880X/tz5111sup4.bin

3D打印数据：MX样品架1。内政部：https://doi.org/10.107/S205979832300880X/tz5111sup5.bin

3D打印数据：MX样品架2。内政部：https://doi.org/10.107/S205979832300880X/tz5111sup6.bin

补充表格和图表。内政部：https://doi.org/10.107/S205979832300880X/tz5111sup7.pdf

致谢

MB感谢Richard Neutze和Aaron Finke对手稿的有益讨论。

资金筹措信息

我们确认MAX IV实验室根据提案20200076在光束线BioMAX上的时间以及Balder光束线上的内部光束时间。瑞典国家用户设施MAX IV的研究由瑞典研究委员会根据合同2018-07152、瑞典创新系统政府机构根据合同2018-104969和Formas根据合同2019-02496提供支持。诺和诺德基金会的NNF17CC0030666赠款支持OA、MM和TU。MB得到了瑞典研究委员会2017-06734号拨款的慷慨支持。

工具书类

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