2.1. ecDHFR的过度表达和纯化

EcDHFR在大肠杆菌用pfolA-ec载体转化后的BL21（DE3）细胞（安捷伦科技）。该矢量携带大肠杆菌folA带有N末端His标签和凝血酶位点的基因，插入pET-28b（Novagen）的NdeI–XhoI位点。细菌培养物培养至OD₆₀₀310时为0.6 含50的LB介质中的K 毫克 我⁻¹卡那霉素。用0.5诱导ecDHFR的表达 米M（M）异丙基β-D类-1-硫代吡喃半乳糖苷。细胞培养4个 诱导后h，离心收获。为了去除残余肉汤，用25 米M（M）Tris–HCl缓冲液pH 7.5，含150 米M（M）氯化钠，193年冷冻储存 K.细胞在25年内再次悬浮 米M（M）Tris–HCl缓冲液pH 7.5，含150 米M（M）氯化钠和0.1 毫克 毫升⁻¹溶菌酶，然后被超声波破坏。裂解物在20℃离心清除 000克对于30 min，将上清液加载到镍-硝基三乙酸（Ni–NTA）-琼脂糖（Qiagen）柱上，用25 米M（M）Tris–HCl缓冲液pH 7.5，含150 米M（M）氯化钠和5 米M（M） β-巯基乙醇(β-ME）。柱用25 米M（M）Tris–盐酸缓冲液pH 7.5，含300 米M（M）氯化钠，20 米M（M）咪唑和5 米M（M） β-我。结合蛋白用25 米M（M）Tris–盐酸缓冲液pH 7.5，含300 米M（M）氯化钠，300 米M（M）咪唑和5 米M（M） β-我。对样本进行25次透析 米M（M）Tris–HCl缓冲液pH 7.5，含150 米M（M）氯化钠和5 米M（M） β-ME去除咪唑。使用凝血酶（GE Healthcare）孵育20小时，去除His标签 295小时 同一列上的第二段将K.ecDHFR与His标签分开。ecDHFR在用25平衡的HiLoad Superdex 75 26/600制备级柱（GE Healthcare）上通过凝胶过滤进一步纯化 米M（M）Tris–HCl缓冲液pH 7.5，含150 米M（M）氯化钠和5 米M（M） β-我。将收集的蛋白质组分与10组分进行透析 米M（M）Tris–HCl缓冲液pH 7.5，浓缩至60 毫克 毫升⁻¹.

2.2。ecDHFR结晶

根据Sawaya和Kraut（1997）的工作，我们使用两种稍微修改的结晶条件来生产两种类型的ecDHFR晶体). ecDHFR–FOL–NADP晶体⁺在277℃获得了具有闭合M20环构象（M20闭合晶体）的配合物 K（K）通过三组分混合物（40）的吊滴蒸汽扩散 毫克 毫升⁻¹欧洲DHFR，5 米M（M）FOL和5 米M（M）NADP公司⁺在10中 米M（M）Tris–HCl pH 7.5）和含18%的储液罐溶液(w个/v（v）)聚乙二醇（PEG）400，100 米M（M）氯化钙，20 米M（M）咪唑缓冲液pH 6.0。使用相同的三元混合物和含有32%的储层溶液获得了具有M20环开构象的晶体（M20开放晶体）(w个/v（v）)聚乙二醇6000，10 米M（M）氯化钙，100 米M（M）咪唑缓冲液pH 6.5。如前所述，通过微进给技术获得了用于高压研究的大单晶（Wan，Kovalevsky等。2014年). M20闭合晶体，空间组 对2₁2₁2₁，增长到0.2×0.5×0.3的典型尺寸 mm在一周内。M20开放式水晶，空间组 对2₁，长到典型尺寸0.2×0.5×0.05 3–4毫米范围内 d。

2.3. 数据收集

作为数据收集的准备步骤，将晶体转移到中压溶液中，在高压下晶体不会降解或溶解。M20闭合晶体浸泡在40%(w个/v（v）)聚乙二醇400、100 米M（M）氯化钙，20 米M（M）咪唑缓冲液pH 6.0过夜，然后转移到50%的溶液中(w个/v（v）)在进行实验之前立即使用PEG 400。M20开放晶体浸泡在35%(w个/v（v）)聚乙二醇6000，10 米M（M）氯化钙，100 米M（M）咪唑缓冲液pH 6.5。使用DAC的HPPX实验在爱知同步辐射中心的名古屋大学光束线BL2S1上进行（爱知SR；渡边等。, 2017)和光子工厂的光束线NW12A（PF-AR；Chavas等。, 2013)，日本。X射线波长为0.71或0.75 ？，波束线的最短实际波长，用于减少DAC的两个菱形砧的吸收，并覆盖DAC开口角限制的最大分辨率。晶体安装在DAC样品室中，并逐渐压缩至所需压力。为了稳定室中的晶体位置，将晶体与捆绑的香烟过滤纤维（Nagae等。, 2012). 由于所有测量都是在室温下进行的，因此在每个压力点使用了几个晶体进行数据采集，以生成完整的数据集，而不会造成严重的辐射损伤。使用红宝石荧光（Zha）的波长偏移在X射线实验前后验证样品室中的压力等。, 2000). 衍射数据集是从压力高达800的M20闭合晶体中收集的 兆帕。M20开放晶体在高达750的压力下衍射相当好 MPa，但在800 兆帕。

使用Rigaku FR-E Cu将晶体安装在玻璃毛细管中，在大气压下从M20开放晶体中进行数据采集 K（K）α配备Rigaku R-AXIS VII探测器的X射线源。表1总结了数据收集条件.

2.4. 数据处理和结构分析

衍射图案通过以下方法进行索引、整合和缩放XDS公司（卡布施，2010年)或香港（HKL）-2000年（Otwinowski和Minor，1997年). 在集成期间，镶嵌用于检测晶体的辐射损伤。只有没有严重损坏的框架被用于结构分析。M20-闭合和M20-开放晶体在常压下的结构由MOLREP公司（Vagin&Teplyakov，2010年)在中实施中央对手方清算所4（优胜者等。, 2011)具有PDB条目的结构1 rx2和1卢比2（Sawaya和Kraut，1997年)分别作为搜索模型。使用大气压力下的结构作为初始模型，对高压下的结构进行了细化。REFMAC公司（穆尔舒多夫等。, 2011)或菲尼克斯（亚当斯等。, 2010)用于结构精细化，并使用库特（埃姆斯利和考坦，2004年).MOLREP公司也用于晶体学相变M20-开晶发生。加入水分子ARP协议/弯曲（Lamzin&Wilson，1993年)或菲尼克斯.数据处理和结构参数精炼表1中也列出了在一系列压力下的原子坐标和结构因子已作为条目保存在PDB中5z6f型,5z6j型,5z6k个,5z6升和5z6米对于0.1、220、400、650和800的M20闭合晶体 分别为MPa和4x5英尺,4x5克,4x5小时,4x5i和4x5焦耳对于M20开晶，温度为0.1、270、500、660和750 分别为MPa。

ecDHFR–FOL–NADP中溶剂排除体积的计算⁺使用执行VOIDOO公司探头半径为1.4 奥伊（Kleywegt&Jones，1994）). 使用以下公式计算内腔的体积CASTp公司探针半径为1.2 奥（邓达斯等。，2006年). 使用绘制图形PyMOL公司第1.8版(https://www.pymol.org).

3.1. 内部空腔

众所周知，ecDHFR中存在几个疏水性内腔（Gekko，2002). 在这项研究中，我们观察到，随着压力的增加，大多数空腔都被压缩了。腔体随压力变化的示例如图1所示ecDHFR内腔的总体积随着压力的增加而减小（图2). 对此，ecDHFR的溶剂排除体积也随压力降低。M20闭合晶体的体积为32 520 Å^三在大气压下，减至31 440 Å^三在800 兆帕。M20-开晶从32 485 Å^三大气压力为30 970 Å^三在660 兆帕。音量略微增加至31 240 Å^三750 MPa，其中非对称的两个分子的体积平均值对2₁ 单位单元格。用分子体积计算的平均压缩系数为4.6×10⁻² 平均绩点⁻¹对于M20闭合晶体和6.9×10⁻² 平均绩点⁻¹对于M20开放晶体，其与之前使用HPPX报道的其他蛋白质的蛋白质相比较（Kundrot&Richards，1987; 阿斯康等。, 2010; 纳加等。, 2012; 山田等。, 2015).

图1 ecDHFR的内腔。(一)0.1和(b条)220个 M20闭合晶体的MPa结构和(c（c）)0.1和(d日) 270 M20开晶的MPa结构。空腔是以表面空腔模式绘制的PyMOL公司使用1.2的溶剂半径 Å. NADP公司+和FOL被视为蛋白质分子的组成部分，而水分子被忽略。NADP公司+、FOL和图3中提到的几种残留物显示为杆模型。对于M20开放式晶体(c（c）)和(d日)对应于B类非对称单元中的链。

图2 M20-封闭和M20-开放ecDHFR晶体的内腔总体积和溶剂排除体积随压力的变化。M20开放晶体在0.1和270时的体积 MPa是非对称单元中两个分子的平均值对21单元格。卷中的错误小于符号大小。

使用1.2，一些空腔缩小到无法检测到 溶剂探针随着压力的增加而增大。例如，Val40、Met42和Leu54旁边的空腔体积在270-500之间急剧下降 M20开晶中的MPa。这种收缩主要是由Leu54侧链的构象变化引起的，如图3所示(一)和3(b条). 事实上，C之间的距离^α空腔周围的Met42和Leu54、Leu54和Arg57以及Val40和Arg58的原子没有显著变化。距离分别为11.1和10.9 奥数，6.2和6.4 以及6.7和7.0 在0.1和750时为 分别为MPa。另一方面，M20开放晶体中Tyr151上方的空腔没有随着压力单调收缩。它的体积明显增加了500到750 水分子穿透时的MPa（图3c（c）和3d日)Leu24侧链翻转，与水渗透相吻合。高压下总空腔体积和分子体积的明显增加，如图2所示可能是由于水渗入空腔。

图3 M20-开放式ecDHFR晶体内腔的放大图。(一)0.1和(b条) 750 显示Leu54附近空腔的MPa结构。被Val40、Met42和Leu54包围的空洞在750时消失 兆帕。(c（c）)0.1和(d日) 750 MPa结构显示水分子渗入Tyr151上方的疏水空腔。空腔是以表面空腔模式绘制的PyMOL公司使用1.2的溶剂半径 Å. NADP公司+和FOL被视为蛋白质分子的组成部分，而水分子被忽略。水的电子密度也绘制为1.5σ.0.1 使用B类链条。

3.2. 压力引起的结构变化

ecDHFR的整体构象随压力的变化如图4所示和5显示M20环周围的电子密度图，NADP⁺和FOL。在M20闭合晶体中，M20环被确认为0.1到400的闭合构象 兆帕；NADP公司⁺FOL也处于适当的位置。650时 MPa时，M20回路的Met16–Asn23部分的电子密度显著降低。此外，当压力增加到800 MPa——M20回路中失去电子密度的区域延伸至Trp30。随着压力的增加，BC、FG和GH回路也变得灵活（图6一). 除了环区外，FOL和NADP的烟酰胺部分的电子密度⁺随着压力的增加而减小（图4c（c）和4d日). 平均值B类FOL因子分别为47和56 Ų650和800 分别为MPa。当我们试图改善FOL的占有率时，它变得70%或更低B类因素。另一方面，M20开晶的M20环更稳定。即使在750的最高压力下 MPa，M20环中的电子密度仍然清楚地覆盖了结构（图5d日). 有趣的是，压力超过500 MPa NADP的烟酰胺部分⁺通过围绕PN-O3键的旋转翻转并投影到溶剂区域。FOL也在500以上波动 MPa，但比M20闭合晶体更稳定。平均值B类FOL的因子仍然低至45 Ų750 在高压下观察到BC和FG环的运动；这与相对稳定的M20和GH回路形成对比（图6b条). NADP翻转后FG回路的位移⁺烟酰胺部分似乎是对相变的主要贡献。

图4 M20环附近的电子密度图，NADP+M20闭合晶体的FOL(一) 0.1, (b条) 400, (c（c）)650和(d日) 800 兆帕。M20回路和FOL的电子密度明显高达400 MPa，但在650时明显变弱 兆帕。涵盖关键结构的电子密度图如1.0所示σ.

图5 M20环附近的电子密度图，NADP+M20开放晶体的FOL(一) 0.1, (b条) 270, (c（c）)500和(d日) 750 兆帕。NADP的烟酰胺部分+在500时翻了个底朝天 MPa，但M20回路和FOL的电子密度在750时仍然很明显 兆帕。电子密度图涵盖了关键结构，如1.0所示σ.中的结构(一)和(b条)属于B类链条。

图6 整体结构变化(一)关闭和(b条)带压力的开放构象。全部关闭0.1、220、400、650和800 MPa，打开0.1、270、500、660和750 MPa结构被叠加。这个B类使用链绘制0.1和270下M20开放晶体的结构 兆帕。根据温度系数，结构被着色为彩虹，最小值为5 Å2最大值为90 Å2.

在M20闭合晶体的FOL结合部位，观察到Ile50侧链的构象变化（图7). 侧链在650下波动 MPa，800时完全翻转 兆帕。在M20开晶中也观察到Leu54的侧链翻转，但Ile50的变化仅在M20闭晶中观察到。

图7 M20闭合晶体中Ile50和Leu54的结构变化(一) 0.1, (b条)400中(c（c）)650和(d日) 800 兆帕。在(c（c）)，Ile50的侧链用两种构象建模。电子密度图涵盖了关键结构，如1.0所示σ英寸(一)和(b条)和0.5σ英寸(c（c）)和(d日).

3.3. 水化结构

通常，观察到的水合水分子数量随着压力的增加而增加（Nagae等。, 2012; 山田等。, 2015); 本研究进一步证实了这一趋势。对于M20闭合晶体，在0.1、220、400、650和800时分配的水分子数为87、135、134、108和41 分别为MPa。M20开放晶体在0.1、270、500、660和750时含有（110、107）、（85、88）、130、137和134个水分子 分别为MPa（括号中的数值对表示A类和B类非对称单元中的链）。M20闭合晶体在800 MPa包含较少数量的水分子，因为分辨率降至2.2 由于循环和辅因子的大量移动。M20开放晶体中的水分子数量在270 MPa可能与相变。M20开晶中表面水合水分子的分布如图8所示值得注意的是，水分子在500时开始在Lys32和Leu36之间渗透 MPa，如图中绿色表面所示。然而，在M20闭合晶体中没有观察到相同的现象（图8（f）).

图8 M20开晶的表面水化水分子(一) 0.1, (b条) 270, (c（c）) 500, (d日)660和(e（电子）) 750 兆帕。0.1和270 MPa结构为B类链条。650时M20闭合晶体的相同表面 MPa也显示在(（f）). 水分子显示为氰球。FOL和NADP+显示为杆模型。Lys32和Leu36处的表面呈绿色。

在M20开晶中，随着压力的增加，在活性部位观察到有趣的水行为，如图9所示Arg57的胍基部分在0.1到660之间与FOL的羧基直接相互作用 兆帕。相反，这种直接的配体-酶相互作用在750时变成了水介导的相互作用 兆帕。N之间的距离^η1或N^η2Arg57原子和FOL的O1或O2原子增加到4.7–5.2 750时的奥数 MPa，BC环构象发生变化（残基51–57；图6b条)，在Arg57和FOL之间清楚地观察到两个水分子。这些水分子位于高压下渗入Lys32和Leu36之间的水分子的氢键网络中（图8).

图9 FOL和NADP附近的水渗透和构象变化+在M20开晶中。(一)0.1和(b条) 750 FOL和Arg57和(c（c）)0.1和(d日) 500 FOL和NADP的MPa结构+.0.1 MPa结构为B类链条。电子密度图涵盖了关键结构和水分子，如1.0所示σ.

如图5所示，NADP的构象变化⁺在相变M20-开放晶体。270以下 MPa，NADP的烟酰胺部分⁺使范德瓦尔斯与FOL的翼状体部分接触。500以上 MPa时，烟酰胺核糖部分通过PN-O3键的旋转离开结合位点。先前与FOL的翼啶部分相互作用的水分子取代了结合位点中的FOL（图9c（c）和9d日). 与Thr46和Tyr100氢键结合的水分子类似于ddTHF–NADPH产物模拟复合物（PDB条目）中观察到的水1个x6). 然而，后者的M20环处于闭塞构造（Sawaya&Kraut，1997）).

4.1. 内腔的压力响应

如图2所示根据勒夏特列原理，分子体积因压力而减小。通过使用HPPX，可以直接观察蛋白质分子内腔的行为（图1和3). 对于偏摩尔体积减少，接受水分子进入内腔也是有效的（柯林斯等。, 2005). 在ecDHFR的情况下，一个水分子在750时渗入Tyr151上方的空腔 MPa（图3d日). 在我们之前关于IPMDH和蛋清溶菌酶（Nagae）的HPPX研究中也观察到了这种现象等。, 2012; 山田等。, 2015). 水分子似乎与Tyr151相互作用通过一对孤独的人–π如我们之前在溶菌酶研究中观察到的相互作用，其中Trp是芳香族残基（山田等。, 2015). 有趣的是，即使在800℃时，在M20闭合晶体中也没有观察到水渗入空腔 兆帕。

内腔容积减少有时与周围氨基酸的侧链构象变化有关。在FOL装订袋旁边的空腔处，Leu54侧链在750处翻转 M20开晶中的MPa（图3b条). Leu54是ecDHFR氢转移反应的重要残基。其与米氏复合体中FOL的范德华相互作用决定了第页-氨基苯甲酸部分（刘等。, 2013). Leu54的这种结构变化似乎与Arg57的底物再认知过程有关，Arg57在αC和βC（图9一和9b条). 空腔中的另一个残基Met42对ecDHFR活性也很重要。Met42是ecDHFR的一个已知动态通信枢纽，其功能是变构调制器（Mauldin&Lee，2010）). Met42突变为粗大侧链可能会减少空腔的体积，并可能影响其周围残基（如Leu54）的侧链的流动性，还可能影响反应动力学ecDHFR的。M42W突变降低了GH环的灵活性，GH环与残基没有直接接触（罗斯顿等。2014年). M42W/G121V突变也影响M20环路动力学（Fan等。, 2013). 这个K（K）_米和k个_猫M42W突变体（Ohmae）的ecDHFR动力学参数显著增加等。, 2005).

4.2. 压力对回路动力学的影响

ecDHFR的M20环采用三种构象（开放、闭合和封闭），对其酶活性很重要（Fierke等。, 1987; Sawaya&Kraut，1997年). 最近，据报道，M20闭环构象影响活性位点的水合作用，并与pK（K）_一基底的N5原子（Mhashal等。, 2017).

在ecDHFR的高压核磁共振研究中，M20环的结构是压敏的（Kitahara等。, 2000). 核磁共振实验中的最大压力为200 MPa，但众所周知，晶体中蛋白质分子的压力响应转移到高压区域（Katrusiak&Dauter，1996; 滨岛等。, 2016). 因此，在我们的HPPX实验中，我们将M20开放和M20闭合晶体加压到750和800 分别为MPa。因此，即使在晶体状态下，我们也成功地观察到了M20回路动力学。

在M20闭合晶体中，回路随着压力的增加而移动。线圈的电子密度在650及以上时变得微弱 兆帕。相比之下，在M20开放晶体的高压下，回路在其原始位置保持相当稳定（图4和5). M20回路的压力响应与ecDHFR主体的压力响应明显不同。环路的构象运动比结构的其他部分要早得多。最近，以压力为参数对M20环进行的计算研究表明，较高的压力有利于开放构象（Huang等。, 2017). 我们的HPPX结果直接证实了M20环在其高能亚态中有利于开放构象。

还观察到其他回路的压力诱导运动（图6). 平均值B类压力降低了整个蛋白质分子的因子，但B类一些环路区域的因子增加。例如，在M20-开晶和M20-闭晶中都可以看到FG回路中128到133之间残基的运动。在800的M20闭合晶体中 MPa，在残基121附近也观察到构象运动。Gly121突变为Val显著降低ecDHFR的活性（Cameron&Benkovic，1997）)提出了Gly121、Met42和Phe125的耦合运动网络（Singh等。, 2015). 还讨论了米氏模型络合物和产物三元络合物之间Val119侧链的构象变化（Tuttle等。, 2013). 在我们的HPPX结果中观察到的环区的压力诱导构象运动可能与这些现象有关。

4.3. NADP的结构变化⁺和叶酸

我们成功地直接观察到了NADP⁺使用M20开晶，烟酰胺部分在晶体状态下翻转（图5第6页和9). NADP的这种构象⁺与核磁共振弛豫分散实验中检测到的高能构象次要状态相同（Boehr等。，2006年). 我们还观察到M20开放晶体中Arg57 FOL识别的中间结构。如图9所示(b条)，两个水分子位于FOL和Arg57之间。即使在使用室温下收集的结构计算的系综模型中，也没有观察到Arg57和这些进入水分子的结构变化（Keedy等。2014年). 压力增加引起的结构变化可以认为是以相反的顺序代表ecDHFR-Michaelis络合物形成过程。

FOL的波动与ecDHFR产品释放过程有关。在M20闭合晶体中，FOL在400之前是稳定的 MPa，但其电子密度在650时变得微弱 MPa（图4)其占用率可通过以下方式调整至0.7左右菲尼克斯定义在M20闭合晶体中，NADP的烟酰胺部分⁺即使在650英尺的高度，仍保持在活跃位置 兆帕。NADP的结构变化⁺不仅对氢化物的转移机理进行了研究，还对产物的释放过程进行了研究。已知ecDHFR的产物释放是辅因子介导的，NADP烟酰胺部分的位置⁺很重要（Oyen等。, 2015, 2017). 在我们的HPPX结果中，M20闭合晶体中的FOL波动程度高于M20开放晶体，其中烟酰胺部分在高压下不再与FOL相邻（图5). 这些结果还表明，在我们的案例中，FOL模拟的ecDHFR产品发布速度比NADP快⁺没有将烟酰胺部分从活性部位翻转出来。

在M20闭合晶体中，在650以上观察到Ile50和Leu54的构象变化 MPa，与FOL增加的波动一致（图7). 伴随FOL波动的Ile50和Leu54的构象变化似乎代表了对封闭的激发态’，之前根据¹核磁共振氢谱化学变换差额（日元等。, 2017). 当Ile50的侧链翻转时，Ile50和Met42之间的相互作用变得更大疏水相互作用在Ile50和第页-FOL的氨基苯甲酰谷氨酸部分变得较弱，导致FOL从口袋中释放出来。另一方面，在M20开晶中，FOL波动低于M20闭晶中，只有Leu54改变了其构象（图3b条)未观察到Ile50的结构变化。