1.简介
在过去的十年里,电子冷冻显微镜(cryo-EM)已经成为一种强有力的工具,能够以足够的分辨率解析生物标本的三维结构,从而提出从头开始原子模型(Kühlbrandt,2014; Smith&Rubinstein,2014年; 程等。, 2017). 这主要是通过发展直接电子探测器(巴塔利亚等。, 2009; Faruqi&McMullan,2011年; 锂等。, 2013; 麦克马伦等。, 2014)以及图像处理算法的改进(Scheres&Carazo,2009; Scheres,2012年). 这些进展的结果是,在电子显微镜数据库(EMDB;https://www.ebi.ac.uk/pdbe/emdb/statistics_mol_wt.html/,https://www.ebi.ac.uk/pdbe/emdb/statistics_min_res.html/).
可以对少量生物样品进行低温EM(微升至飞升范围;Russo&Passmore,2016; 阿什蒂亚尼等。, 2018; Noble,魏等。, 2018)在相对较短的时间内(从几小时到几天;基马尼乌斯等。,2016年; Cianfrocco公司等。, 2018). 用于低温电子显微镜的合适样品是均匀的,并均匀地分布在整个支撑孔的随机方向上。然而,许多生物标本是具有内在灵活性、构象异质性或采用首选定向在玻璃化的冰层中(诺盖尔斯等。,2016年; 普拉什卡等。, 2017). 通过优化样品的生化制备,改变支撑格栅的类型和化学性质,可以减少此类问题(Meyerson等。, 2014; Russo&Passmore,2014年; 波兰德等。, 2017; 线路接口单元等。, 2019)并使用不同的洗涤剂(Takizawa等。, 2017; 德鲁莱特等。, 2018; 陈等。, 2019). 所有这些都可能导致在各种条件下收集数据的必要性。对于低浓度样品,或者当固有的异质性或首选粒子取向难以消除时,收集大量低温电子显微镜数据是一个有效的选择。例如,具有罕见视图的粒子数量可能会在大型数据集中得到丰富,因为分布和方向在很大程度上取决于冰的厚度(Casañal等。, 2017; 诺布尔,丹迪等。, 2018). 此外,大数据集可以进行广泛的分类,以计算分离不同状态下的粒子亚群(费尔南德斯等。, 2013; 乌尔纳维希乌斯等。, 2015; 马佐夫等。, 2017; 威尔金森等。, 2018; 查伦顿等。, 2019; 郭等。, 2019).
在收集和处理如此大的低温电子显微镜数据集时,存在许多实际限制。研究所或低温电子显微镜设施内缺乏充足的显微镜时间,这意味着用户通常会在其所在研究所内或世界各地的专用低温电子显微镜设备中使用不同的显微镜收集多个数据集(Casañal等。, 2017; 曼尼等。, 2018; 菲卡等。, 2019). 此外,当显微镜正在维修或升级时(例如并入新的探测器或能量过滤器),或者当需要更改数据采集的放大倍数时(例如增加分辨率或每张图像的粒子数),用户可能会以不同的像素大小进行采集。缺乏一种简化的程序来组合像素大小不同的低温电子显微镜数据,这对结构测定在单粒子项目中。在这里,我们描述了两种简单的方法来组合低温电子显微镜数据集(图1和2). 我们提出两个案例研究。在第一个实验中,数据集是使用两个不同的Titan Krios显微镜收集的,它们具有相似的放大倍数。在第二个实验中,在同一台Titan Krios显微镜上以不同的放大倍数进行数据采集。
| 图1 冷冻电子显微镜数据缩放的两种方法的示意图概述。在方法1中,在提取颗粒之前缩放显微照片(粉红色箭头)(蓝色箭头)。在方法2中,提取粒子,然后缩放,如果需要,可以使用可选的裁剪步骤。 |
| 图2 数据融合过程的流程图。这两种方法的第一步是获得独立的三维重建,以计算数据集之间的比例因子。方法1在显微照片级别重新缩放数据,方法2使用提取的粒子。必须重新进行CTF估计(方法1)或将缩放因子应用于散焦值以重新计算CTF(方法2)。合并两个数据集中的粒子后(中的“Join”作业RELION公司),可以使用标准程序进行进一步处理。星号(*)表示在哪里提供脚本来执行流程中的不同步骤:1*,确定相对像素大小.py; 2*,重新缩放文章.py; 3*,scale_ctf.sh(缩放系数); 4*中,盒式缩放器.py. |
2.程序
2.2. 通过互相关确定数据集之间的比例因子
原则上,通过互相关确定数据集之间的比例因子很简单。所需要的只是每个数据集的独立3D重建。通过将不同相对像素大小的贴图相互关联,可以确定其缩放因子。为了说明这一概念(并随后演示方法1;第2.3.1节),裂解和多聚腺苷酸化因子(CPF)聚合酶模块的两个不同数据集酿酒酵母使用,以1.40的标称像素大小收集 Å每像素(数据集I,MRC-LMB的Krios 2)和1.36 每像素奥数[数据集II,金刚石光源(DLS)电子生物成像中心(eBIC)](卡萨纳尔等。, 2017). 为了计算相对像素大小并缩放数据,使用较大像素大小(1.40)的数据集的像素大小 每像素奥;参考文献;本例中的数据集I)应保持不变,同时更改第二个数据集(1.36)的相对像素大小 每像素奥;数据集II)。
致谢
我们感谢Thomas G.Martin和Takanori Nakane在脚本编写方面的帮助,感谢Shabih Shakel的有益讨论,感谢Lori A.Passmore和Kiyoshi Nagai监督有关切割和多腺苷酸化因子及剪接体的工作,感谢Loli A.Passmere、Sjors H.W.Scheres、Takanori-Nakane、,拉斐尔·费尔南德斯·莱罗(Rafael Fernández-Leiro)和安德烈亚斯·博兰德(Andreas Boland)对手稿的建议和批判性阅读。我们感谢Jake Grimmet和Toby Darling在高性能计算方面的帮助。CPF聚合酶模块和P复合物剪接数据集的原始显微照片胶片和粒子坐标已分别存放在EMPL-EBI的EMPIAR数据库中,登记号为EMPIAR-10299和EMPIAR-100298。3.30的低温电磁图 P络合物的光学分辨率重建已沉积在电子显微镜数据库,注册号EMDB-10140。脚本可以在支持信息和github中找到(https://github.com/maxewilkinson/CryoEM-scripts网站).
资金筹措信息
这项工作得到了欧洲分子生物学组织长期研究金ALTF66-2015的支持,该研究金由欧洲委员会(LTFCOFUND2013,GA-2013-609409)通过玛丽·居里行动(AC)、盖茨·剑桥(AK)、剑桥-卢瑟福纪念博士奖学金(MEW)、,欧盟地平线2020研究与创新计划(ERC拨款725685)(发给Lori A.Passmore)、医学研究委员会(MC_U105184330和MC_U105 192715)和欧洲研究委员会高级拨款(AdG-693087-SPLICE3D)(发给Kiyoshi Nagai)。
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| 结构 生物学 |
编号:2059-7983
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