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研究交流\（\def\h填{\hskip5em}\def\hfil{\hski p3em}\def\eqno#1{\hfil{#1}}\）

期刊徽标结构生物学
通信
国际标准编号：2053-230X
第78卷| 第2部分| 2022年2月| 第45-51页
https://doi.org/10.107/S2053230X21013455

晶体结构甜菜碱醛脱氢酶类鼻疽伯克霍尔德菌

十字标记徽标
迪伦·K·比尔德,一 Sandhya Subramanian阶,b、，c（c） 简·阿本德罗斯,c、，天 大卫·M·德拉诺,天 托马斯·爱德华兹,c、，天 彼得·迈勒b、，c、，e（电子）和奥卢瓦托音A.Asojo一*

一汉普顿大学化学与生物化学系，地址：100 William R.Harvey Way，Hampton，VA 23668，USA，b条美国西雅图市西雅图西湖大道北307号500室西雅图儿童研究所全球传染病研究中心，邮编98109，c（c）西雅图传染病结构基因组中心（SSGCID），美国华盛顿州西雅图，天UCB-美国华盛顿州班布里奇岛班布里奇，邮编98110e（电子）美国华盛顿大学全球健康系、生物医学信息学和医学教育系，西雅图，WA 98195
*通信电子邮件：oluwatoyin.asojo@hamptonu.edu

美国休斯顿贝勒医学院蔡富珍主编(收到日期：2021年11月1日； 2021年12月19日接受； 在线2022年1月27日)

类鼻疽伯克霍尔德菌感染会导致类鼻疽，如果不治疗，通常会致命。有必要开发新的更有效的类鼻疽治疗方法。本研究报道了潜在药物靶点甜菜碱醛脱氢酶（BADH）的载脂蛋白和辅因子结合晶体结构假鼻疽杆菌通过结构比较，确定了与BADH的相似性铜绿假单胞菌被药物二硫仑抑制。这一初步分析有助于药物再利用研究假鼻疽杆菌.

PDB参考：甜菜碱醛脱氢酶；绑定到辅因子，6wsb

类似文章

1.简介

类鼻疽伯克霍尔德菌是一种杆状、活动、有鞭毛、土壤膨胀的革兰氏阴性蛋白杆菌，属于伯克霍尔德菌科，在热带和亚热带地区生长旺盛等。, 2021【Gassiep，I.，Burnard，D.，Bauer，M.J.，Norton，R.E.&Harris，P.N.（2021），《未来微生物》，第16期，第271-288页。】).假鼻疽杆菌导致类鼻疽，这是一种致命的新出现的机会性感染，主要是免疫功能低下（霍尔等。, 2019【霍尔，C.M.，贾拉米洛，S.，希门尼斯，R.，斯通，N.E.，森特纳，H.，布施，J.D.，布拉奇，N.，罗伊，C.C.，吉，J.E.，霍夫马斯特，A.R.，里维拉-加西亚，S; 坡等。, 1971[Poe，R.H.，Vassallo，C.L.和Domm，B.M.（1971年），《责任书修订本》第104卷，第427-431页。]; 维卢萨特等。, 2021【Veluthat，C.，Venkatarayan，K.，Padaki，P.&Krishnaswamy，U.M.（2021年）。BMJ案例报告14，e242499。】).假鼻疽杆菌通过开放性伤口、接触受污染的土壤和水、摄入或吸入传播，也是一种潜在的生物战剂（Goarant等。, 2021【Goarant，C.、Dellagi，K.和Picardeau，M.（2021），耶鲁大学生物医学杂志，94，351-360。】)。类鼻疽病在南亚和澳大利亚北部流行，约165 每年1000例；然而假鼻疽杆菌未知，因为相关疾病被低估和误诊（帕蒂尔等。, 2016【Patil，H.G.、Gundavda，M.、Shetty，V.、Soman，R.、Rodriques，C.和Agache，V.M.（2016年），J.Orthop.13、40-42。】; 坡等。, 1971[Poe，R.H.，Vassallo，C.L.和Domm，B.M.（1971年），《责任书修订本》第104卷，第427-431页。]; 维卢萨特等。, 2021【Veluthat，C.，Venkatarayan，K.，Padaki，P.&Krishnaswamy，U.M.（2021年）。BMJ案例报告14，e242499。】)。典型的情况是，美国大陆每年报告大约12例类鼻疽病例，大多数患者曾出国旅行；然而，假鼻疽杆菌在波多黎各和美属维尔京群岛（霍尔等。, 2019【霍尔，C.M.，贾拉米洛，S.，希门尼斯，R.，斯通，N.E.，森特纳，H.，布施，J.D.，布拉奇，N.，罗伊，C.C.，吉，J.E.，霍夫马斯特，A.R.，里维拉-加西亚，S)。类鼻疽症状包括局部疼痛和肿胀、溃疡、咳嗽、头痛、厌食、关节疼痛、脑感染、癫痫、发热、肺炎、低血压和脓肿（霍尔等。, 2019【霍尔，C.M.，贾拉米洛，S.，希门尼斯，R.，斯通，N.E.，森特纳，H.，布施，J.D.，布拉奇，N.，罗伊，C.C.，吉，J.E.，霍夫马斯特，A.R.，里维拉-加西亚，S; 坡等。, 1971[Poe，R.H.，Vassallo，C.L.和Domm，B.M.（1971年），《责任书修订本》第104卷，第427-431页。]; 维卢萨特等。, 2021【Veluthat，C.，Venkatarayan，K.，Padaki，P.&Krishnaswamy，U.M.（2021年）。BMJ案例报告14，e242499。】)。因此，类鼻疽可能被误诊为肺结核、肺炎或其他疾病（Veluthat等。, 2021【Veluthat，C.，Venkatarayan，K.，Padaki，P.&Krishnaswamy，U.M.（2021年）。BMJ案例报告14，e242499。】)。接触后几天或几年可能出现症状，未经治疗的类鼻疽的死亡率约为90%（Loveleena等。, 2004[Loveleena，Chaudhry，R.&Dhawan，B.（2004）。印度医师协会杂志，52417-420。]; 帕蒂尔等。, 2016【Patil，H.G.、Gundavda，M.、Shetty，V.、Soman，R.、Rodriques，C.和Agache，V.M.（2016年），J.Orthop.13、40-42。】; 坡等。, 1971[Poe，R.H.，Vassallo，C.L.和Domm，B.M.（1971年），《责任书修订本》第104卷，第427-431页。]; 维卢萨特等。, 2021【Veluthat，C.，Venkatarayan，K.，Padaki，P.&Krishnaswamy，U.M.（2021年）。BMJ案例报告14，e242499。】)。类鼻疽目前通过静脉注射抗菌药物（头孢他啶或美罗培南）治疗2至8周，然后进行3至6个月的口服抗菌药物治疗（阿莫西林/克拉维酸或甲氧苄啶-磺胺甲恶唑），但仍会导致约40%的死亡率（Fen等。, 2021【Fen，S.H.Y.，Tandhavanant，S.，Phunpang，R.，Ekchariyawat，P.，Saiprom，N.，Chewapreecha，C.，Seng，R..，Thiansukhon。E.&Chantratita，N.（2021年）。抗微生物。代理Chemother。65，e02230-20。])。作为开发类鼻疽新疗法和诊断方法的一部分，西雅图传染病结构基因组中心（SSGCID）确定了晶体结构甜菜碱醛脱氢酶（BADH）假鼻疽杆菌(Bp公司BADH）。BADH催化甜菜碱醛不可逆氧化为渗透保护剂甜菜碱，并被研究为耐药细菌的药物靶点，尤其是铜绿假单胞菌，因为它的抑制作用阻止胆碱分解代谢并导致高毒性甜菜碱醛的积累（González-Segura等。, 2009【González-Segura，L.，Rudiño-Piñera，E.，Muñoz-Clares，R.A.&Horjales，E.（2009），《分子生物学杂志》385，542-557。】).

2.材料和方法

2.1. 生产Bp公司BADH公司

作为西雅图传染病结构基因组中心（SSGCID；Myler）的一部分，进行了克隆、表达和纯化等。, 2009[Myler，P.J.、Stacy，R.、Stewart，L.、Stager，B.L.、Van Voorhis，W.C.、Varani，G.和Buchko，G.W.（2009）《感染与疾病药物靶点》，第9期，第493-506页。]; 斯泰西等。, 2011【Stacy，R.，Begley，D.W.，Phan，I.，Stager，B.L.，Van Voorhis，W.C.，Varani，G.，Buchko，G.W.，Stewart，L.J.&Myler，P.J.（2011），《结晶学报》F67，979-984。】)遵循前面描述的标准协议（Bryan等。, 2011【Bryan，C.M.，Bhandari，J.，Napuli，A.J.，Leibly，D.J.，Choi，R.，Kelley，A.，Van Voorhis，W.C.，Edwards，T.E.&Stewart，L.J.（2011），《结晶学报》第67期，第1010-1014页。】; 崔等。, 2011【Choi，R.，Kelley，A.，Leibly，D.，Nakazawa Hewitt，S.，Napuli，A.&Van Voorhis，W.（2011），《结晶学报》F67，998-1005。】; 塞族钦斯基等。, 2015【塞尔维津斯基，D.A.，克利夫顿，M.C.，桑卡兰，B.，斯塔克，B.L.，爱德华兹，T.E.&迈勒，P.J.（2015），《结晶学报》F71，594-599。】)。甜菜碱醛脱氢酶全长基因假鼻疽杆菌(Bp公司BADH；UniProt Q3JLL8）编码氨基酸1–489，使用表1中所示的引物从基因组DNA中进行PCR扩增[链接].

表1
大分子生产信息

源生物 类鼻疽伯克霍尔德菌1710亿
DNA来源 Samuel I.Miller博士，美国华盛顿大学
正向底漆 5′-ATGTCCCGTATACGTCTGCAGC-3′
反向底漆 5′-GAACCGGTTGAGCGGCC-3′
表达式向量 pMCSG26型
表达式宿主 大肠杆菌BL21（DE3）R3罗塞塔细胞
产生的构建体的完整氨基酸序列 MSVYGLQRLYIAGAHADATSGKTFDTFDPDPATGELLARVQQASADDVDVRAVASAREGQREWAAMTAMQRSRILRRAVELLRERNDALAELEMRDTGKPIAETRAVDIVTGADVIEYYAGLATAIIEGLQVPLRPESFVYTRREPLEGAGAWNYPIQIACWKSAPALAAAGNAMIFKPSEVTPLSALDAIVASEAGVPAFNVQGSVGALLSAHPGAKVSFTGKKVMSLAGASSLKEVTMELGGSPLIFDDADIAVTANFFSAGQVCTNGTRVFVQQAVKDAFVER VLARVARIRVGKPSDSDTNFGPLASAAQLDKVLGYIDSGKAEGAK（沃尔瓦里尔夫）LLAGGARLVNDHFASGQYVAPTVFGDCRDMRIVREEIFGPVMSILS保护EAIARANATDY GLAAGVENLSRAHRAIHRLEAGICCWINTWGESPAEMPVGYKQSGGRENGITTLEHYTRIKSVQVELGRYQPVGHHHH

该基因被克隆到连接无关克隆中（LIC；Aslanidis&de Jong，1990）【Aslanidis，C.&de Jong，P.J.（1990）。核酸研究18，6069-6074。】)表达载体pMCSG26（Eschenfeldt等。, 2010【Eschenfeldt，W.H.，Maltseva，N.，Stols，L.，Donnelly，M.I.，Gu，M.，Nocek，B.，Tan，K.，Kim，Y.&Joachimiak，A.（2010），《结构功能基因组学杂志》，11，31-39。】)编码一个不可清除的C末端6×His融合标签（ORF-GHHHHHH）。质粒DNA转化为化学活性大肠杆菌BL21（DE3）R3罗塞塔电池。对含有Q3JLL8的质粒进行了表达测试，2 l培养物采用自诱导培养基培养（Studier，2005）【Studier，F.W.（2005）。蛋白质实验纯化。41207-234。】)如前所述，在LEX生物反应器（Epiphyte Three Inc.）中等。, 2015【塞尔维津斯基，D.A.，克利夫顿，M.C.，桑卡兰，B.，斯塔克，B.L.，爱德华兹，T.E.&迈勒，P.J.（2015），《结晶学报》F71，594-599。】)。表达克隆BupsA.00020.b.AE1.GE43326可在https://www.ssgcid.org/available-materials/expression-clones网站/.

Bp公司BADH-His的纯化采用两步方案，包括固定化金属亲和力色谱法（IMAC）步骤和尺寸排除色谱法（美国证券交易委员会）。全部色谱法根据之前描述的程序（Bryan等。, 2011【Bryan，C.M.，Bhandari，J.，Napuli，A.J.，Leibly，D.J.，Choi，R.，Kelley，A.，Van Voorhis，W.C.，Edwards，T.E.&Stewart，L.J.（2011），《结晶学报》第67期，第1010-1014页。】)。解冻后的细菌颗粒于200年通过超声波溶解 ml裂解缓冲液{25 米M（M）4-（2-羟乙基）-1-哌嗪乙烷磺酸（HEPES）pH 7.0500 米M（M）氯化钠，5%甘油，0.5%3-[（3-胆酰胺丙基）二甲基铵]-1-丙基磺酸（CHAPS），30 米M（M）咪唑，10 米M（M）氯化镁2, 1 米M（M）三（2-羧乙基）膦盐酸盐（TCEP），250 微克 毫升−14-（2-氨基乙基）苯磺酰氟盐酸盐（AEBSF），0.025%叠氮化钠}。经超声处理后，用20 µl（25 单位 微升−1)苯甲酸酶，在室温下混合培养45 min。在10时通过离心使裂解液澄清 000 转速 最小值−1对于1 h使用Sorvall离心机（Thermo Scientific）。对于IMAC步骤，将澄清的上清液通过Ni–NTA HisTrap FF 5 ml柱（GE Healthcare），使用加载缓冲液（25）进行预平衡 米M（M）HEPES pH值7.0500 米M（M）氯化钠、5%甘油、30 米M（M）咪唑，1 米M（M）TCEP，0.025%叠氮化钠）。用20个柱体积的加载缓冲液（CV）清洗色谱柱，并用加载缓冲液和250洗脱色谱柱 米M（M）咪唑的线性梯度超过7 CV。峰分数，由280的紫外线吸收测定 nm）合并并使用Amicon浓缩器浓缩至体积为5 ml用于SEC。对于SEC，SEC柱（Superdex 75，GE）与运行缓冲液[25平衡 米M（M）HEPES pH值7.0500 米M（M）氯化钠、5%甘油、2 米M（M）二硫苏糖醇（DTT），0.025%叠氮化钠]。收集洗脱后的峰馏分并分析其是否存在Bp公司通过SDS–PAGE进行BADH。SEC峰值分数包含Bp公司BADH以分子质量为～77的单个大峰洗脱 千帕。二聚体Bp公司预计BADH的分子质量为～106 kDa，而单体的分子量为～53 千帕。Bp公司在没有辅因子的情况下，BADH可能是单体，而在辅因子或其他配体的存在下，它会二聚。需要进一步的生物物理分析来确定Bp公司在溶液中存在NAD时，BADH会二聚。有趣的是，在超过175个已报道的BADH结构中，PDB中含有配体、辅因子和抑制剂，二聚体与观察到的晶体形式一致Bp公司带有NAD的BADH（图1[链接]).

[图1]
图1
的结构假鼻疽杆菌甜菜碱醛脱氢酶(Bp公司BADH）。(一)载脂蛋白单体Bp公司BADH（彩虹色，N端为蓝色，C端为红色(b条)的二聚体Bp公司带有NAD的BADH（单体显示为海蓝宝石和青色色带，NAD显示为棒状）。

将峰分数合并并浓缩至34.72 毫克 毫升−1使用Amicon集中器（Millipore）。使用OD评估蛋白质浓度280摩尔消光系数为46 870 M（M）−1 厘米−1.将纯化的蛋白质加入200 微升等分试样，在液氮中闪速冷冻，并在−80°C下储存，直到用于结晶。纯化蛋白（批次BupsA.00020.b.AE1.PS38619）可在https://www.sgcid.org/available-materials/ssgcid-proteins（网址：https://www.sgcid.org/available-materials/ssgcid-proteins）/.

2.2。结晶

纯化的Bp公司针对JCSG++HTS（Jena Bioscience）、MCSG1（Molecular Dimensions）和Morpheus（Rigaku试剂；Gorrec，2009【Gorrec，F.（2009），《应用结晶杂志》，第42期，第1035-1042页。】, 2015【Gorrec，F.（2015），《水晶学报》F71，831-837。】)水晶屏幕。apo结构的蛋白质溶液不含NAD，而4 米M（M）将NAD添加到蛋白质溶液中以获得NAD结合复合物（表2[链接])。等体积蛋白质溶液（0.4 µl），沉淀溶液设置为287 K相对于水库（80 µl）以坐滴式蒸汽扩散格式。最终结晶沉淀剂为apo形式的JCSG+条件F7和NAD结合形式的Morpheus条件H11（见表2[链接])。在将低温保护剂交换到补充有20%乙二醇的结晶溶液中后，收集晶体并将其投入液氮中进行闪蒸冷却。

表2
结晶

方法 坐滴式蒸汽扩散
板材类型 96-well Compact 300，里加库
温度（K） 287
蛋白质浓度（mg 毫升−1) 34.72
蛋白质溶液的缓冲液成分
 载脂蛋白晶体 25 米M（M）HEPES pH值7.0500 米M（M）氯化钠、5%甘油、2 米M（M）DTT，0.025%叠氮化物
 NAD结合晶体 25 米M（M）HEPES pH值7.0500 米M（M）氯化钠、5%甘油、2 米M（M）DTT，0.025%叠氮化物，4 米M（M）北美
储层溶液的组成
 Apo结构 JCSG+条件F7:0.8 M（M）琥珀酸盐pH 7.0
 NAD绑定结构 睡眠状况H11:10%PEG 4000，20%甘油，0.02 M（M）钠L（左）-谷氨酸，0.02 M（M） DL公司-丙氨酸，0.02 M（M）甘氨酸，0.02 M（M） DL公司-赖氨酸，0.02 M（M） DL公司-丝氨酸，0.1 M（M）bicine/Trizma pH 8.5
体积和落差 0.4 µl蛋白质加0.4 µl储液罐
储液罐容积（µl） 80
防冻剂 20%乙二醇

2.3. 数据收集和处理

数据收集于100 阿贡国家实验室先进光子源（APS）光束线21-ID-F上的K（见表3[链接])。数据集减少了XSCALE公司（卡布施，2010年【Kabsch，W.（2010），《结晶学报》，D66，125-132。】)。原始X射线衍射图像可从高分子晶体学再现性综合资源获取，网址：https://www.proteindiffraction.org/.

表3
数据收集和处理

括号中的值用于外壳。
PDB代码 6个工作区 6磅
配体 — 北美
衍射光源 21-ID-F，APS 21-ID-F，APS
波长（Ω） 0.97872 0.97872
温度（K） 100 100
探测器 RayoniX MX300HE CCD RayoniX MX300HE CCD
晶体到探测器的距离（mm） 270 200
每张图像的旋转范围（°） 1 1
总旋转范围（°） 60 150
“空间”组 对6222 对21212
一,b条,c（c）(Å) 107.86, 107.86, 233.53 99.27, 156.70, 76.23
α,β,γ(°) 90, 90, 120 90, 90, 90
镶嵌度（°） 0.143 0.103
分辨率范围（Ω） 49.51–2.05 (2.10–2.05) 43.09–1.55（1.59–1.55）
反射总数 362438 (26952) 1054995 (75766)
独特反射次数 51154 (3702) 172302 (12622)
完整性（%） 99.9 (99.9) 99.9 (100.0)
多重性 7.09 (7.28) 6.12 (6.00)
〈我/σ(我)〉 12.86 (3.50) 16.47 (3.02)
R（右）相对湿度。 0.101 (0.548) 0.083 (0.621)
总体B类Wilson图中的因子（Å2) 32.748 20.398

2.4. 结构解决和细化

这些结构由分子置换具有相位器（麦考伊等。2007年【McCoy，A.J.，Grosse-Kunstleve，R.W.，Adams，P.D.，Winn，M.D.，Storoni，L.C.&Read，R.J.（2007），《应用结晶杂志》，第40期，第658-674页。】)来自中央对手方清算所4套程序（协作计算项目，第4期，1994年[合作计算项目，第4期（1994年），《晶体学报》，D50，760-763。]; 克里斯内尔等。, 2004【Krissinel，E.B.，Winn，M.D.，Ballard，C.C.，Ashton，A.W.，Patel，P.，Potterton，E.A.，McNicholas，S.J.，Cowtan，K.D.&Emsley，P.（2004），《水晶学报》，D60，2250-2255。】; 温等。, 2011[Winn，M.D.，Ballard，C.C.，Cowtan，K.D.，Dodson，E.J.，Emsley，P.，Evans，P.R.，Keegan，R.M.，Krissinel，E.B.，Leslie，A.G.W.，McCoy，A.，McNicholas，S.J.，Murshudov，G.N.，Pannu，N.S.，Potterton，E.A.，Powell，H.R.，Read，R.J.，Vagin，A.&Wilson，K.S.（2011），《基督学报》，D67，235-242。])使用PDB条目2个（迪亚斯·桑切斯等。, 2011【Díaz-Sánchez，A.G.，González-Segura，L.，Rudiño-Piñera，E.，Lira-Rocha，A.，Torres-Larios，A.&Muñoz-Clares，R.A.（2011），《生物化学杂志》第439卷，第443-452页。】)作为搜索模型。使用以下迭代循环细化结构凤凰（利布施内尔等。, 2019[Liebschner，D.，Afonine，P.V.，Baker，M.L.，Bunkóczi，G.，Chen，V.B.，Croll，T.I.，Hintze，B.，Hung，L.-W.，Jain，S.，McCoy，A.J.，Moriarty，N.W.，Oeffner，R.D.，Poon，B.K.，Prisant，M.G.，Read，R.J.，Richardson，J.S.，Ricchardson，D.C.，Sammito，M.D.，Sobolev，O.V.，Stockwell，D.H.，Terwilliger，T.C.，Urzhumtsev，A.G.，Videau，L。L.、Williams、C.J.和Adams，P.D.（2019年）。《水晶学报》。第75页，861-877页。])然后使用手动重建结构库特（埃姆斯利和考坦，2004年【Emsley，P.&Cowtan，K.（2004），《水晶学报》，D60，2126-2132。】; 埃姆斯利等。, 2010【Emsley，P.、Lohkamp，B.、Scott，W.G.和Cowtan，K.（2010），《水晶学报》D66、486-501。】)。使用摩尔概率（陈）等。, 2010【Chen，V.B.、Arendall，W.B.、Headd，J.J.、Keedy，D.A.、Immormino，R.M.、Kapral，G.J.，Murray，L.W.、Richardson，J.S.和Richardsson，D.C.（2010），《晶体学报》，D66，12-21。】)。所有数据还原和细化统计如表4所示[链接].载脂蛋白的结构Bp公司BADH和Bp公司BADH和NAD的分辨率分别为2.05和1.55 分别为：。使用PyMOL公司（德拉诺，2002【DeLano，W.L.（2002），PyMOL。https://www.pymol.org。])。生成了多个序列比对Clustal欧米茄（李等。, 2015【Li，W.，Cowley，A.，Uludag，M.，Gur，T.，McWilliam，H.，Squizzato，S.，Park，Y.M.，Buso，N.&Lopez，R.（2015）.核酸研究43，W580-W584.】)。坐标和结构因子已保存在蛋白质数据库中(https://www.rcsb.org/; 伯曼等。, 2000[Berman，H.M.、Westbrook，J.、Feng，Z.、Gilliland，G.、Bhat，T.N.、Weissig，H.、Shindyalov，I.N.和Bourne，P.E.（2000）。核酸研究28，235-242。])具有加入编号6个工作区和6磅用于apoBp公司BADH和Bp公司BADH分别与NAD复合物。

表4
结构解决和细化

括号中的值用于外壳。
PDB代码 6个工作区 6磅
配体 甘油 北美
分辨率范围（Ω） 49.51–2.05 (2.08–2.05) 43.09–1.55 (1.57–1.55)
完整性（%） 96.1 96.4
σ截止日期 F类> 0.000σ(F类) F类> 0.000σ(F类)
反射次数，工作集 49171（1957年） 166209 (4765)
反射次数，测试集 2932 (109) 10050 (297)
最终R（右）晶体 0.140 (0.2203) 0.144 (0.2064)
最终R（右）自由的 0.173 (0.2521) 0.169 (0.2342)
十字柄DPI 0.183 0.070
非H原子数量
 蛋白质 3666 7322
 离子 1 —
 配体 60 100
 溶剂 501 1388
 总计 4228 8810
R.m.s.偏差
 粘结长度（Ω） 0.006 0.006
 角度（°） 0.775 0.85
平均B类因子（λ2)
 蛋白质 33 15.3
 离子 32.1 —
 配体 58.9 31.7
 水 42.6 30.8
拉马钱德兰阴谋
 最受欢迎（%） 97.1 97.1
 允许（%） 2.9 2.9

3.结果和讨论

这里报告的两个结构是apoBp公司BADH及其与辅因子NAD的复合物（图1[链接])。单体非常相似，r.m.s.d.为～0.17 对于主链原子来说，是ω。每个单体中的489个氨基酸增加了20.4%β-股，39.3%α-螺旋，2.5%310-螺旋和37.8%的环，形成6个β-α-β包含五个图案β-薄片（四片混合，一片反平行）。该结构还包含21个螺旋，21股，四股β-发夹，四个β-凸起和25个螺旋-螺旋相互作用。Bp公司BADH具有典型的BADH拓扑结构，与铜绿假单胞菌(帕BADH；图2[链接])。489-氨基酸序列帕BADH折叠为19.6%β-股，38.2%α-螺旋，2.5%310-螺旋和39.7%的环（图2[链接]).

[图2]
图2
结构和主序列对齐Bp公司BADH和帕BADH公司。所示的二级结构元素为α-螺旋线(α), 310-螺旋线(η),β-？股(β)和β-圈数（TT）。相同的残基在红色背景上以白色显示，保守的残基以红色显示。

这两种生物BADH的结构相似性和基序可能会加速药物发现工作。帕已知BADH通过催化半胱氨酸（Velasc-Garcia）被二硫仑抑制等。, 2006[Velasc-García，R.，Zaldívar-Machorro，V.J.，Müjica-Jiménez，C.，González-Segura，L.&Muñoz-Clares，R.a.（2006）.《生物化学与生物物理研究》，Commun.341，408-415.]); 因此，我们假设Bp公司BADH同样会被二硫仑抑制。二硫化氢与Cys286不可逆结合帕BADH，位于高度保守的辅因子结合腔中帕BADH和Bp公司巴德；相应的残留物为Cys285 inBp公司BADH（图2[链接]和3[链接])。二硫化氢是一种不可逆的抑制剂，它会导致甜菜碱醛的积累，从而在细菌细胞中产生毒性。细菌细胞中的毒性会阻止细菌生长（Velasco-Garcia等。, 2006[Velasc-García，R.，Zaldívar-Machorro，V.J.，Müjica-Jiménez，C.，González-Segura，L.&Muñoz-Clares，R.a.（2006）.《生物化学与生物物理研究》，Commun.341，408-415.])。由于二硫仑被FDA批准用于治疗慢性酒精中毒，初步研究表明，它可以被重新用作治疗类鼻疽的先导化合物。此外，由于帕BADH和Bp公司BADH表示，前者在药物研发方面的经验教训可以加快解决类鼻疽的努力。

[图3]
图3
LIGPLOT公司分析表明Bp公司BADH（PDB条目6磅)和帕BADH（PDB条目4立方英尺)非常保守（圆圈表示相同的残基）。两种结构都显示保守的催化半胱氨酸被二硫仑不可逆地抑制。

4.结论

甜菜碱醛脱氢酶的高分辨率结构假鼻疽杆菌(Bp公司BADH）和铜绿假单胞菌(帕BADH）揭示了保守的NAD依赖拓扑和结构相似性。由于抑制剂结合位点中的关键氨基酸残基是保守的，因此以前的研究帕BADH可以促进小分子抑制剂的开发Bp公司BADH公司。

支持信息

3D视图

PDB参考：甜菜碱醛脱氢酶；绑定到辅因子，6wsb


致谢

SSGCID联盟由Peter Myler博士（首席研究员）领导，由多个中心的许多不同科学家组成，致力于确定生物防御有机体和新发传染病蛋白质的三维结构。我们要特别感谢全球传染病研究中心、华盛顿大学和UCB的SSGCID克隆、蛋白质生产和X射线晶体学小组。

资金筹措信息

根据2017年9月1日第HHSN272201700059C号合同，这项工作得到了国家过敏和传染病研究所（NIAID）、国家卫生研究院（NIH）、卫生与公共服务部的联邦资金支持。（SSGCID于2012年9月1日至2017年8月31日根据NIAID合同编号HHSN272201200025C获得资助，于2007年9月28日至12年9月27日根据HHSN27200700057C获得资助。）Dylan K.Beard是汉普顿大学化学教育与导师课程本科研究试点项目（HU-ChEM CURES）的一部分由NIGMS资助（授予OAA编号1U01GM138433-01）。

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国际标准编号：2053-230X
第78卷| 第2部分| 2022年2月| 第45-51页
https://doi.org/10.107/S2053230X21013455