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.1997年11月;3(11):1233-47.

人mRNA(N6-腺苷)甲基转移酶AdoMet-binding亚基的纯化和cDNA克隆

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人mRNA(N6-腺苷)甲基转移酶AdoMet-binding亚基的纯化和cDNA克隆

J A Bokar博士等。 核糖核酸. 1997年11月.

摘要

真核生物mRNA中内部腺苷残基的甲基化,形成N6-甲基腺苷(m6A),是由一种复杂的多组分酶催化的。先前的研究表明,m6A影响mRNA处理或转运的效率,但其发生机制尚不清楚。为了更好地理解这种普遍存在的转录后修饰的机制和功能,我们已经证明,HeLa mRNA(N6-腺苷)-甲基转移酶需要至少两个单独的蛋白因子,即MT-a和MT-B,并且MT-a包含70-kDa亚基(MT-A70)上的AdoMet结合位点。通过常规色谱和电泳纯化MT-A70,并进行微序列测定。该肽序列用于设计一个简并的寡核苷酸,该寡核苷酸反过来用于从HeLa cDNA文库中分离编码MT-A70的cDNA克隆。重组MT-A70作为融合蛋白在细菌中表达,并用于在兔中产生抗MT-A70的抗血清。这些抗血清通过western blot识别HeLa核提取物中的MT-A70,并能够消耗HeLa细胞核提取物中的(N6-腺苷)甲基转移酶活性,证实MT-A70是(N6-腺苷)甲基化转移酶的关键亚基。Northern blot分析表明,MT-A70 mRNA存在于多种人类组织中,并可能经历选择性剪接。MT-A70 cDNA探针与从HeLa细胞中分离的2.0 kb多腺苷酸化RNA杂交,而使用从六种不同的人类组织中分离的mRNA与两种主要RNA物种(约2.0 kb和3.0 kb)杂交。对cDNA序列的分析表明,它编码一个580-氨基酸蛋白,预测分子量为65kDa。预测的蛋白质包含与原核DNA(N6-腺苷)甲基转移酶中确定的一致甲基化基序I和II相似的序列,表明肽基序的功能保持。MT-A70还包含与酵母蛋白SPO8的长同源区,其通过未知机制参与孢子形成的诱导。

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