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.1997年6月24日；94(13):6927-32.
doi:10.1073/pnas.94.13.6927。

RAB22和RAB163/小鼠BRCA2：与RAD51蛋白特异性相互作用的蛋白质

瑞穗（R Mizuta） 1, J M拉萨尔, H L Cheng先生, 一个Shinohara, H小川, N科普兰, N A詹金斯, M拉兰德, F W Alt键
附属公司

RAB22和RAB163/小鼠BRCA2：与RAD51蛋白特异性相互作用的蛋白质

瑞穗（R Mizuta）等。 美国国家科学院程序. .

摘要

人类RAD51蛋白是参与同源重组和DNA修复的细菌RecA和酵母RAD51蛋白质的同源物。RAD51与参与重组的蛋白质相互作用，也与肿瘤抑制蛋白p53和乳腺癌易感基因1（BRCA1）相互作用。我们使用酵母双杂交系统克隆了编码RAD51相关分子RAB22和RAB163的小鼠cDNA序列。RAB163编码小鼠BRCA2的C末端部分，BRCA2是人类第二乳腺癌易感基因蛋白的同源物，表明RAD51和BRCA2之间存在体外关联。RAB22是一种新型基因产物，在体外也与RAD51相互作用。为了检测体内RAD51的相互作用，我们开发了一种瞬态核焦点分析，用于证明RAB22与RAD51在大型核焦点中的完全共定位。

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图1
图1
通过酵母双杂交分析分离的RAD51相关cDNA克隆。(一)全长RAB22的预测氨基酸序列，编码337个氨基酸。在GenBank中没有观察到与其他序列的显著同源性。该cDNA序列的GenBank登录号为U93583。(b条)RAB22的四个代表性cDNA片段以粗体线显示，克隆名称列在右侧。JG4-5–RAB22是通过酵母双杂交筛选分离的原始克隆。RAB22-5是使用从JG4-5–RAB22制备的cDNA探针从小鼠胸腺文库中克隆的，但在编码区中包含56核苷酸缺失（δ56）。RAB22-5′-6是用AP1和RAB22-1R两个引物（箭头）从小鼠睾丸文库中扩增出的片段，不含缺失。RAB22是由RAB22-5和RAB22-5'-6构建的全长cDNA克隆。如前所述，细垂直线是限制性内切酶位点。(c（c）)RAB163肽与小鼠BRCA2（mBRCA2）肽的相对位置用氨基酸编号和箭头表示。已报道mBRCA2的全长cDNA序列（26）。
图2
图2
分析RAB22型表达式。(上部)用全长RAB22 cDNA探测多个小鼠组织的总RNA。(下部)28S和18S rRNA的溴化艾替啶染色显示了每条通道中总RNA的相对数量。
图3
图3
两者的染色体位置受监资产基础小鼠基因组中的基因座。受监资产基础通过种间回交分析绘制基因座。重组N的数量2动物数量超过N2动物在每对基因座之间的染色体图左侧打字。还显示了重组频率，以厘摩根（±1SE）的遗传距离表示。当基因座之间未发现重组体时，重组距离的95%置信上限在括号中给出。通过最小化解释等位基因分布模式所需的重组事件数量来确定基因顺序。已知的人类染色体上的基因座位置显示在染色体图的右侧。大多数人类基因座的地图位置参考可从基因组数据库中获得，基因组数据库是由约翰·霍普金斯大学（巴尔的摩）威廉·H·韦尔奇医学图书馆维护的人类连锁信息的计算机数据库。
图4
图4
RAD51与RAB22或RAB163之间的特定关联在体外通过GST亲和力下拉分析。35生成了S标记的RAD51（≈40 kDa，车道1）、RAB22（≈45 kDa（车道2））、RAB163/mBRCA2（≈）35 kDa、车道3）、XRCC4（≈53 kDa；车道4）和荧光素酶（≈60 kDa）在体外并在SDS/PAGE后可视化。对于这些车道，2.5μl在体外-翻译产物在凝胶上分离。每个在体外-翻译蛋白（15μl反应）也与GST-RAD51融合蛋白孵育，该融合蛋白在细菌中合成并固定在谷胱甘肽-脑葡萄糖珠（40μl）上。在用1×NETN缓冲液多次洗涤后，将珠子悬浮在25μl的2×样品缓冲液（2%十二烷基硫酸钠/10%甘油/0.01%溴酚蓝）中，煮沸，然后旋转以使珠子成球状。然后用SDS/PAGE分析每个上清液的5μl；RAD51（车道6）、RAB22（车道7）、RAB163/mBRCA2（车道8）、XRCC4（车道9）和荧光素酶（车道10）。
图5
图5
通过TrNF分析在离散核病灶中对RAD51和RAB22进行定殖。(A类——D类)用pGFP–RAB22和pRc/CMV–RAD51构建物瞬时转染CHO-K1细胞，随后用抗RAD51抗血清和罗丹明结合二级抗体染色。图中显示了转染阳性细胞的典型细胞核。(A类)DAPI核复染灰度。(B类)pGFP–RAB22定位，绿色病灶。(C类)pRc/CMV–通过抗体检测进行RAD51定位，红色病灶。免疫前血清未观察到病灶（数据未显示）。(D类)的合并图像A类——C类。当绿色和红色信号重叠时，观察到黄色信号，表明RAB22和RAD51的同位化。DNA复染为蓝色。(E类——G公司)CHO-K1细胞与pGFP–RAB22和pBFP–RAD51构建物瞬时共转染，并直接分析核病灶。(E类)pBFP–RAD51定位，蓝色焦点。(F类)pGFP–RAB22定位，绿色病灶。(G公司)在的合并图像中E类和F类，浅绿色焦点表示蓝色和绿色信号的同位化。
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