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.1997年6月2日;185(11):2025-32.
doi:10.1084/jem.185.11.2025。

V(D)J重组:全细胞提取物和DNA弯曲蛋白对12/23底物上RAG1和RAG2切割活性的调节

附属公司

V(D)J重组:全细胞提取物和DNA弯曲蛋白对12/23底物上RAG1和RAG2切割活性的调节

D J Sawchuk公司等。 实验医学杂志. .

摘要

抗原受体基因重排由DNA基序指导,该基序由由12或23个碱基对(12或23重组信号序列[RSS])的非保守间隔区分隔的保守七聚体和九聚体组成。V(D)J重组要求重新排列的DNA片段两侧有不同间隔长度的RSS,这一现象称为12/23规则。最近的研究表明,这种限制作用在DNA切割水平上,DNA切割由重组激活基因RAG1和RAG2的产物介导。这里,我们表明RAG1和RAG2不足以进行12/23依赖性切割,而RAG1与RAG2与全细胞提取物互补,忠实地再现了12/23规则。此外,含有HMG1和HMG2蛋白的HMG盒增强RAG1和RAG2介导的含有23个RSS的底物的裂解,但不增强仅含有12个RSS底物的底物。这些结果表明在裂解位点存在核蛋白复合物,由结构、催化和调节成分组成。

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数字

图1
图1
切割试验中使用的DNA底物示意图(未按比例绘制)。32每个探针5′端和3′端的P合并用星号表示。12和23个重组信号序列分别显示为12 RSS和23 RSS。请注意,262-bp产品包含一个32P分子和571 bp有两个32P分子,从571-bp片段中产生两倍更高的信号。
图2
图2
观察到12/23通过全细胞提取物调节切割。(一个)RAG1/RAG2共转染293T全细胞提取物的裂解活性(R1/2 WCE系列)在12/23和12/12切割探针上。(B类)RAG1/RAG2共转染293T全细胞提取物的裂解活性(R1/2 WCE系列)在12/23和23/23解理探针上。(C类)铜化RAG1/RAG2的裂解活性(第1/2页)在12/23和12/12解理探针上。注释了12 RSS处解偶联解理产生的900-bp产物。星号表示隐秘的解理位点。(D类)纯化RAG1/RAG2的互补实验(第1/2页)和未转染的293全细胞提取物(WCE公司),使用12/23和12/12基板。(E类)纯化RAG1/RAG2的裂解活性(第1/2页)在存在或不存在未转染293T全细胞提取物的情况下,在12/23和23/23裂解探针上(WCE公司),如图所示。所有样品在4.5%天然聚丙烯酰胺凝胶上溶解,然后进行自动射线照相。显示了未分离的1151-bp 12/12基板、未分离的1172-bp 23/23基板和未分离的1162-bp 12/23基板的位置。571和262 bp注释表明了所有情况下预期耦合解理产物的位置。所有解理产物的大小和迁移通过底物的限制性分析独立确认。每个实验中使用放射性标记的1-kb大小标记作为独立的大小标记。所用蛋白质和提取物的所有体积均以微升表示。
图2
图2
通过全细胞提取物观察12/23调节卵裂。(一个)RAG1/RAG2共转染293T全细胞提取物的裂解活性(R1/2 WCE系列)在12/23和12/12解理探针上。(B类)RAG1/RAG2共转染293T全细胞提取物的裂解活性(R1/2 WCE系列)在12/23和23/23切割探针上。(C类)铜化RAG1/RAG2的裂解活性(第1/2页)在12/23和12/12切割探针上。注释了12 RSS处解偶联解理产生的900-bp产物。星号表示隐秘的解理位点。(D类)纯化RAG1/RAG2的互补实验(第1/2页)和未转染的293全细胞提取物(WCE公司),使用12/23和12/12基板。(E类)纯化RAG1/RAG2的裂解活性(第1/2页)在存在或不存在未转染293T全细胞提取物的情况下,在12/23和23/23裂解探针上(WCE公司),如图所示。所有样品在4.5%天然聚丙烯酰胺凝胶上溶解,然后进行自动射线照相。显示了未分离的1151-bp 12/12基板、未分离的1172-bp 23/23基板和未分离的1162-bp 12/23基板的位置。571和262 bp注释表明了所有情况下预期耦合解理产物的位置。所有解理产物的大小和迁移通过底物的限制性分析独立确认。每个实验中使用放射性标记的1-kb大小标记作为独立的大小标记。所用蛋白质和提取物的所有体积均以微升表示。
图3
图3
DNA弯曲蛋白对RAG介导的切割活性的影响。(一个)纯化RAG1/RAG2的活性(第1/2页)在12/23底物上,在没有或存在纯化的高迁移率族蛋白1或2的情况下(HMG1型HMG2型分别),重组HMG1(rHMG1型),集成主机因素(IHF公司)和HU蛋白。尺寸标记如上图所示。(B类)纯化RAG1/RAG2的活性(第1/2页)在12/12底物上,在没有或存在纯化HMG1或HMG2、rHMG1、IHF和HU蛋白的情况下。(C类)纯化RAG1/RAG2的活性(第1/2列)在23/23和分离的23RSS(23i)底物上,在没有或存在rHMG的情况下。图右侧的尺寸标注指的是23i探头。
图3
图3
DNA弯曲蛋白对RAG介导的切割活性的影响。(一个)纯化RAG1/RAG2的活性(第1/2页)在12/23底物上,在没有或存在纯化的高迁移率族蛋白1或2的情况下(HMG1型HMG2型分别),重组HMG1(rHMG1型),集成主机因素(IHF公司)和HU蛋白。尺寸标记如上图所示。(B类)纯化RAG1/RAG2的活性(第1/2页)在12/12底物上,在没有或存在纯化HMG1或HMG2、rHMG1、IHF和HU蛋白的情况下。(C类)纯化RAG1/RAG2的活性(第1/2页)在23/23和分离的23RSS(23i)底物上,在没有或存在rHMG的情况下。图右侧的尺寸标注指的是23i探头。
图4
图4
未转染293对RAG介导的卵裂的联合作用WCE公司、rHMG1和纯化的RAG1/RAG2。(一个)12/23底物上R1/2、rHMG1和WCE指示组合的活性。尺寸标记如上图所示。(B类)12/12底物上R1/2、rHMG1和WCE的活性。(C类)23/23底物上R1/2、rHMG1和WCE的活性。(D类)R1/2、rHMG1和WCE公司在隔离的23RSS基底上。

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