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.2022年2月；28(2):210-226.
doi:10.1261/rna.078946.121。 Epub 2021年11月18日。

红霉素抗性甲基转移酶ErmE的三个关键区域是支持Erm家族酶与底物rRNA相互作用模型的功能所必需的

罗里·沙基 1, 约翰尼·赫伯特 1, 丹妮尔·麦加哈 1, Vy Nguyen（维·阮） 2, 艾琳·J·舍弗勒 2, 杰克·A·邓克 1
附属公司

红霉素抗性甲基转移酶ErmE的三个关键区域是支持Erm家族酶与底物rRNA相互作用模型的功能所必需的

罗里·沙基等。 核糖核酸. 2022年2月.

摘要

DNA和RNA的6-甲基腺苷修饰广泛存在于生命的三个领域，通常由Rossmann-fold甲基转移酶结构域完成，该结构域包含保守序列元素，指导S-腺苷蛋氨酸辅因子结合并将靶腺苷残基放置到活性部位。对保守的罗斯曼折叠和附加结构域的细化将甲基化直接转化为不同的DNA和RNA序列和结构。最近，核糖体RNA腺嘌呤二甲基酶（RRAD）家族成员与rRNA结合的第一个原子再溶结构被解决，TFB1M与12S rRNA的螺旋45结合。由于红霉素抗性甲基转移酶也是RRAD家族的成员，为了了解这些酶如何识别rRNA，以对抗其在抗生素耐药性中的作用，我们基于TFB1M-rRNA结构构建了ErmE与23S rRNA片段结合的模型。我们基于该模型设计了ErmE的定点突变体，并用纯化蛋白进行了体内表型分析和体外分析。我们的结果和其他生物信息学分析表明，我们的结构模型捕获了关键的ErmE-rRNA相互作用，并表明Erm蛋白的三个区域在甲基化中起着关键作用：靶腺苷结合囊、基本脊和α4-裂。

关键词：RNA修饰；抗生素耐药性；甲基化；甲基转移酶；rRNA。

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数字

图1。
图1。
TFB1M–rRNA晶体结构表明rRNA腺嘌呤二甲基酶家族的其他成员如何与底物RNA结合(A类)来自模型生物的rRNA腺嘌呤二甲基酶（RRAD）家族蛋白质的谱系图。(B类)显示了由两个RRAD家族成员ErmE和TFB1M执行的甲基化反应的示意图。这两种蛋白质都能使与基对茎区相邻的腺苷残基发生二甲基化。(C类)最近解决了TFB1M与底物结合的晶体结构，揭示了其与rRNA相互作用的细节。
图2。
图2。
ErmE叠加在与rRNA结合的TFB1M上表明ErmE区域与rRNA接触(A类)图中显示了ErmE（pdb代码6nvm）与与其RNA底物结合的TFB1M结构的叠加。在ErmE和TFB1M之间观察到高度的结构相似性，特别是在罗斯曼折叠（RF）催化结构域中。羧基末端结构域（CTD）在这两种结构之间变化。螺旋α4、α5和α6在RNA结合中发挥中心作用。(B类)ErmE–TFB1M叠加的详细视图显示，一个关键芳香残基（TFB1M F144，ErmE Y134）和一个基本残基（TFB1M R183，ErmE-K164）位于两个结构之间的同一附近，但ErmE必须经历构象变化才能像TFB1M–RNA晶体结构一样结合RNA。
图3。
图3。
ErmE与其23S rRNA底物结合的计算模型表明，三个区域对RNA识别至关重要。(A类)Rosetta Relax计算得出的三个模型的叠加显示，残基E160、K164和R171显示为棒状。指出了Rossmann-fold（RF）催化结构域和羧基末端结构域（CTD）。(B类)图中显示了所获得的所有模型与0425模型的Cα原子的Rosetta分数与均方根（RMS）偏差的关系。(C类)Rosetta模型0515强调了蛋白质的三个区域与rRNA的相互作用：腺苷囊、基本补丁和α4裂。
图4。
图4。
腺苷囊、α4裂和基本脊的定点突变体的红霉素抗性表型。(A类)本文详细介绍了ErmE与rRNA螺旋73结合的理论模型。该模型预测了驱动RNA识别的非共价相互作用中的残基。23S rRNA显示为金色，选择的氨基酸根据它们位于ErmE的哪个区域而着色：腺苷口袋（粉红色）、α4-左（蓝色）和碱性斑块（绿色）。(B类)使用每类Erm蛋白中的一个代表对三个相关位点的序列保护进行建模。(C类)测量红霉素的最小抑制浓度（MIC）大肠杆菌表达ErmE定点突变体的细胞。实验采用琼脂稀释法，不加抗生素佐剂苯基精氨酸-β-萘胺（PAβ），或液体培养法，在PAβ存在下进行微量稀释实验。(D类)当细胞表现出红黏菌素敏感表型时，使用western blotting验证ErmE位点导向突变体的表达和稳定性。
图5。
图5。
与红粘蛋白敏感表型相关的ErmE定点突变体在体外显示RNA甲基化缺陷。(A类)野生型ErmE及其变体的SDS-PAGE分析表明，这些蛋白相当纯净，并显示出预期的分子量。(B类)野生型ErmE和变体产生类似的圆二色光谱，表明变体中的蛋白质结构没有重大变化。(C类)使用单一周转动力学分析来表征通过从基本补丁区域选择的定点突变体进行的RNA甲基化。三H（H）-S公司-腺苷甲硫氨酸（SAM）被用作甲基供体以跟踪产物的形成，从而将放射性同位素标记的甲基基团（红圈）从SAM转移到RNA(D类)对来自腺苷囊和α4-裂的定点突变体进行单翻转动力学分析。图中显示了三次重复的散点图以及由非线性回归得出的最佳拟合线。
图6。
图6。
测定了所选定点ErmE突变体的RNA亲和结合。(A类)利用RNA上的5′荧光素标记，通过荧光偏振法测量ErmE变体与模拟23S rRNA螺旋73的RNA寡核苷酸的亲和力结合(B类)图中显示了分析中每个ErmE变量的三个重复的散点图以及非线性回归拟合。胃蛋白酶滴定的单次重复显示为RNA结合的阴性对照（阴性）。
图7。
图7。
E160定点突变株的红霉素抗性表型。(Α)ErmE–RNA结构模型表明rRNA的E160和G2057之间存在氢键。基本脊为绿色，α4为半蓝色，Ade为粉红色。(B类)测量红霉素的最小抑制浓度（MIC）大肠杆菌表达E160定点突变体的细胞。实验采用琼脂稀释法，不加抗生素佐剂苯基精氨酸-β-萘胺（PAβ），或液体培养法，在PAβ存在下进行微量稀释实验。(C类)当细胞表现出红黏菌素敏感表型时，使用western blotting验证ErmE位点导向突变体的表达和稳定性。
图8。
图8。
甲基化动力学和RNA亲和力结合测量与E160在ErmE-RNA模型中的位置一致。(A类)利用ErmE变体进行RNA甲基化的单翻转动力学分析三H（H）-S公司-腺苷蛋氨酸（SAM）作为甲基供体。在限制SAM或限制RNA的条件下进行分析。使用模拟23S rRNA螺旋73的寡核苷酸作为底物。图中显示了三个重复的散点图以及由非线性回归确定的最佳拟合线。(B类)使用荧光标记的RNA寡核苷酸通过荧光偏振法测量E160变异体对螺旋73类似物的结合亲和力。显示了wt、E160A和E160W三个重复的散点图。胃蛋白酶滴定的单次重复显示为RNA结合的阴性对照（阴性）。E160W对RNA的亲和力降低，与RNA的空间位阻相一致，但E160A没有。
图9。
图9。
临床样本中ES rm的序列保守性分析。序列标识由病原衍生的Erm序列生成，以分析穿过腺苷囊、α4裂和基本脊的序列变异。序列来自NCBI MicroBIGG-E，这是一个抗菌药物耐药基因数据库，源自与食源性疾病爆发相关的临床样本和样本的下一代测序数据。子类型显示在左边; MBE指所有MicroBIGG-E序列。
图10。
图10。
人类rRNA腺嘌呤二甲基化酶家族成员和ErmC在ErmE上的重叠突显了α4裂的结构变异。(A类)由pdb代码6aax给出的人类TFB1M叠加到我们的ErmE–rRNA模型上。该视图强调α4裂区。(B类)由pdb代码6w6c给出的人类DIMT1叠加到我们的ErmE–rRNA模型上。(C类)由pdb代码1qao给出的细菌ErmC叠加到我们的ErmE–rRNA模型上。在所有情况下，为了简单起见，只显示了酶的催化域。
罗里·沙基
罗里·沙基
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