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.2020年11月13日；370(6518):861-865.
doi:10.1126/science.abd3072。 Epub 2020 10月20日。

Neuropilin-1是SARS-CoV-2感染的宿主因子

詹姆斯·戴利 # 1, 鲍里斯·西蒙内蒂 # 2, 卡贾·克莱因 # 三, 陈开恩 # 4, 迈亚·卡瓦纳·威廉姆森 # 三, 卡洛斯·安托恩·普拉加罗 # 1, Deborah K鞋印 5, 洛雷娜·西蒙·格拉西亚 6, 迈克尔·鲍尔 7, 雷卡·霍兰迪 8, 你的F Greber 7, 彼得·霍瓦思 8 9, Richard B会话 1, 阿里·海伦纽斯 10, 朱利安·希斯科克斯 11 12, 坦贝特·蒂萨鲁 6, 大卫·A·马修斯 三, 安德鲁·戴维森 三, 布雷特·M·柯林斯 4, 彼得·库伦 2, 山内洋平 13 14
附属机构

Neuropilin-1是SARS-CoV-2感染的宿主因子

詹姆斯·戴利等。 科学类. .

摘要

严重急性呼吸综合征冠状病毒2型（SARS-CoV-2）是2019年冠状病毒病（COVID-19）的病原体，使用病毒尖峰（S）蛋白附着和进入宿主细胞。宿主蛋白酶furin将全长前体S糖蛋白裂解为两种相关多肽：S1和S2。S的裂解在S1上产生一个多碱基Arg-Arg-Ala-Arg羧基末端序列，该序列符合C末端规则（CendR）基序，该基序与细胞表面神经细胞素-1（NRP1）和NRP2受体结合。我们使用x射线晶体学和生物化学方法证明S1-CendR基序直接结合NRP1。通过RNA干扰或选择性抑制剂阻断这种相互作用降低了严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2型的进入和细胞培养中的传染性。因此，NRP1是SARS-CoV-2感染的宿主因子，可能为新冠肺炎提供治疗靶点。

PubMed免责声明

利益冲突声明

竞争性利益

T.Teesalu是CendR肽专利的发明者，也是Cend Therapeutics Inc.的股东，该公司持有CendR多肽的许可证，正在开发用于癌症治疗的多肽。J.Hiscox是卫生部新出现呼吸道病毒威胁咨询小组（NERVTAG）和卫生部测试咨询小组的成员。U.Greber是瑞士F.Hoffmann-La Roche有限公司的顾问。所有其他作者都声明没有相互竞争的利益。

数字

图1
图1。NRP1与S1相互作用并增强SARS-CoV-2感染。
(A类)转染表达ACE2的HEK293T细胞转染表达GFP或GFP标记的S1，24h后裂解。将裂解产物置于GFP纳米陷阱中，并对免疫隔离物进行ACE2和NRP1（N=3）的印迹。(B类)联合转染HEK293T细胞以表达GFP标记的S1或GFP-S1ΔRRAR和mCherry或mCherry-标记的NRP1，并对其进行GFP纳米捕捉（N=5）。双尾非配对t检验；P=0.0002。(C类)赫拉重量+ACE2和HeLa尼泊尔卢比1 KO+用SARS-CoV-2感染ACE2细胞。将细胞固定在6或16 hpi，并对N蛋白（品红色）和Hoechst（青色）进行染色，并量化病毒感染性（N=3）。双尾非配对t检验；P=0.00002和0.00088。比例尺=200μm。(D类)表达针对NRP1或非靶向对照（SCR）shRNA的Caco-2细胞感染SARS-CoV-2并固定在7或16 hpi。对细胞进行N蛋白（洋红色）和Hoechst（青色）染色，并量化感染性（N=3）。双尾非配对t检验；P=0.0005和0.00032。比例尺=500μm。(E类)Caco-2 shSCR或shNRP1细胞接种MOI=50的SARS-CoV-2，在冷培养60 min后固定。使用抗S和-N抗体进行两步抗体染色程序，以区分外部（绿色）和总（红色）病毒颗粒，并对每种情况下超过3300个颗粒的每细胞颗粒结合进行量化（N=3）。双尾不成对t检验；P=0.6859。(F类)Caco-2 shSCR或shNRP1细胞与SARS-CoV-2结合，如(E类)，然后在37°C下培养30分钟。细胞固定并染色，如(E类). 对每种情况下超过4200粒的病毒摄取进行了量化（N=3）。双尾非配对t检验；P=0.00079。比例尺(E类)和(F类)=10μm和200 nm（变焦面板）。放大方形区域。条形图、误差条形图、圆圈和三角形表示平均值，SEM(B类)和SD(首席财务官)，单个数据点*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，***P<0.001，****P<0.0001。
图2
图2。SARS-CoV-2 S1与NRP1的CendR结合的分子基础。
(A类)在两种不同的pH条件下（N=3），ITC将NRP1 b1与天然（绿线）和突变（橙线）形式的S1-CendR肽（对应于残基679-685）结合。所有ITC图都表示具有1比1绑定的集成和规范化数据拟合。(B类)左：NRP1 b1–S1 CendR肽复合物与NRP1 b1–VEGF-A融合复合物叠加（PDB ID:4DEQ）。结合肽以棒状表示。RMSD=均方根偏差。右图：放大图，突出显示S1-CendR肽b1的结合。b1上的键结合残留物如棒状图所示。(C类). HEK293T细胞与GFP标记的S1的组合共转染493-685和S1493-685R685D和mCherry或mCherry-NRP1 b1，并受到mCherry-nanotrap（N=5）的影响。双尾非配对t检验；P<0.0001。(D类). 用GFP标记的S1联合转染HEK293T细胞493-685和mCherry，mCherry-NRP1 b1或mCherry-NRP1 b1 T316R突变体，并经受mCherry-nnotrap（N=5）。双尾非配对t检验；P<0.0001。(E类)希拉牌手表尼泊尔卢比1KO+转染GFP、NRP1 wt-GFP或NRP1 T316R-GFP构建物的ACE2细胞24小时后感染SARS-CoV-2。在16 hpi时，对细胞进行固定并对SARS-CoV-2-N进行染色，并在GFP阳性细胞亚群中量化病毒感染（N=3）。将感染的百分比标准化为GFP转染的细胞的感染百分比。双尾非配对t检验；p=0.002。条形图、误差条形图和圆圈代表SEM的平均值(C-D公司)和SD(E类)，单个数据点*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，***P<0.001，****P<0.0001。
图3
图3。选择性抑制S1-NRP1相互作用可减少SARS-CoV-2感染。
(A类)使用涂有NRP1 b1b2野生型、b1b2-突变型（S346A、E348A、T349A）或BSA的平板，以3μg/mL的速度对抗NRP1单克隆抗体（mAb#1、mAb#2、mAb#13）进行ELISA，用作对照（N=3）。结合表示为655 nm处吸光度的任意单位。双尾非配对t检验；P=0.0207，0.2430，0.0007。(B类)在感染SARS-CoV-2之前，用100μg/mL抗H11N3（Ctrl）单克隆抗体、1、2或3号单克隆抗体预处理细胞1小时。将细胞固定在16 hpi，并对N蛋白（品红色）和Hoechst（青色）进行染色（N=3）。双尾非配对t检验；P=0.015，0.36，0.0003。比例尺=500μm。(C类)将mCherry或mCherry-b1与GFP标记的S1联合转染HEK293T细胞493-685并与mAb#3（N=3）共同孵育或不与mCherry-nanotrap共孵育。双尾不成对t检验；P=0.0143。(D类)NRP1 b1–S1 CendR肽复合物与NRP1 b1–EG00229抑制剂复合物叠加（PDB ID:3I97）。b1、结合肽和EG00229上的关键结合残基如棒状图所示。(E类)两种不同pH条件下EG00229与NRP1的b1结构域结合的ITC分析。与EG00229预培养可阻断S1-CendR肽结合（橙色线），而CendR肽可减少EG00229的结合（绿色线）。（N=3）。所有ITC图都表示具有1比1绑定的集成和规范化数据拟合。(F类). 在感染SARS-CoV-2之前，用100μM EG00229或DMSO预处理细胞。将细胞固定在7和16 hpi，并对N蛋白（品红色）和Hoechst（青色）进行染色（N=3）。放大方形区域。比例尺=500μm和100μm（缩放面板）。双尾非配对t检验；P=0.0059和0.0013。条形图、误差条形图、圆和三角形表示平均值、SEM(C类)和SD(A、 B、F)和单个数据点*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，***P<0.001，****P<0.0001。
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