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.2020年9月3日;107(3):499-513.
doi:10.1016/j.ajhg.2020.06.018。 Epub 2020年7月27日。

MAPK1功能增强导致RAS病临床谱中的神经发育障碍

玛丽亚莱齐亚·莫塔 1卢卡·潘诺 2弗朗西丝卡·潘塔莱奥尼 1吉安弗兰科·博钦福索 弗朗西丝卡·克莱门蒂娜电台 1塞雷娜·切切蒂 4安德烈亚·乔尔菲 1玛蒂娜·迪·洛科 5玛丽亚特·瓦尔廷 6伊娃·H·布里斯特拉 7斯特凡妮娅·波尼 8劳拉·马扎蒂 9费德里卡·坦布里诺 9拉里·沃尔什 10凯特琳·佩恩 10阿尔贝托·费尔南德斯·贾恩 11神话般的加纳帕提 12温迪·K·钟 13多萝西·K·格兰奇 14阿西塔·达维·瓦拉 15沙利尼·C·雷斯米 16丹尼斯·巴托洛缪 15丹妮尔·穆拉斯 15乔瓦娜·卡彭蒂埃里 2亚历山德罗·布鲁塞尔 17西蒙·皮兹 1伊曼纽尔·贝拉基奥 1弗朗西丝卡·皮切西·帕萨西奥 18克里斯蒂娜·李·尤斯基(Christina Lißewski) 19朱莉娅·布林克曼 19罗纳德·瓦卡夫 20昆滕·韦斯菲兹 6科恩·范·加斯森 7英格丽德·温岑森 21米歇尔·莫罗 21萨拉·阿尔瓦雷斯 22莫尼卡·马丁内斯·加西亚 22亚历山德罗·德卢卡 18路易吉备忘录 23朱塞佩·扎皮诺 24塞萨尔·罗西 25马可·斯里 25布鲁斯·德·盖尔布 26马汀·泽克尔 19布鲁诺·达尔拉皮科拉 1洛伦佐·斯特拉 卡洛斯·普拉达 27西蒙·马丁内利 17Elisabetta Flex公司 17马可·塔塔格里亚 28
附属公司

MAPK1功能增强导致RAS病变临床谱内的神经发育障碍

玛丽亚莱齐亚·莫塔等。 美国人类遗传学杂志. .

摘要

通过RAF-MEK-ERK途径进行的信号转导是首次描述的有丝分裂原相关蛋白激酶(MAPK)级联,介导多种细胞过程并参与早期和晚期发育程序。通过这个级联的异常信号有助于肿瘤的发生,并且是RAS病的基础,RAS病是一个致癌疾病家族。在这里,我们报道了编码有丝分裂原活化蛋白激酶1(即细胞外信号调节蛋白激酶2,ERK2)的MAPK1的从头错义变体,导致RAS表型谱内的神经发育疾病,使人想起一些受试者的努南综合征。致病性变体促进激酶磷酸化增加,从而增强向细胞核的移位,并在体内外增强MAPK信号传导。鉴定出两个变体类别,其中一个直接破坏与MKP3的结合,MKP3是一种负向调节ERK功能的双特异性蛋白磷酸酶。重要的是,由致病性MAPK1变体驱动的信号失调是刺激依赖性的,并保留对MEK活性的依赖性。我们的数据支持一个模型,在该模型中,已识别的致病性变体通过差异性影响激酶与调节因子和底物相互作用的能力,对MAPK1功能产生抵消作用,这可能解释了这些变体作为促发肿瘤的驱动事件的次要作用。在发现第一个与努南综合征有关的基因PTPN11近20年后,MAPK级联的最后一层加入了RAS疾病中突变的基因组。

关键词:秀丽线虫;ERK2;MAPK级联;MKP3;努南综合征;RAS信号;RAS病;RSK;外显子组测序;细胞内信号传导。

PubMed免责声明

利益冲突声明

I.M.W.和M.M.M.是GeneDx的员工。圣安娜。和M.M.-G.是NimGenetics的员工。所有其他作者都声明没有相互竞争的利益。

数字

图1
图1
患者的临床特征新成立MAPK1变量受试者1至7的面部特征。注意到出现了肥大、下睑裂、上睑下垂、低置/后旋耳伴明显的对耳垂和耳垂伴中央凹陷、长人中伴明显的柱状物、明显的上唇朱红色和外翻的下唇以及短/有蹼的颈部。受试者1、2、3、4和6的颅面特征类似于NS或相关RAS病。受试者2随年龄变化的表型如图S3所示。
图2
图2
疾病病因的异位表达地图1突变等位基因促进MAPK1(a)MAPK磷酸化分析的可变增强刺激依赖性磷酸化和核转运。显示了三个独立实验的代表性斑点(下图)和报告平均±SD密度测定值的图表(上图)。DRS处的受影响残基映射显示为蓝色,而激活段处的映射显示为粉红色。用所示的Xpress-tagg瞬时转染HEK293T细胞地图1构建,血清饥饿(16 h),在时间过程实验中用EGF(30 ng/mL)刺激或不治疗。在10%聚丙烯酰胺凝胶上溶解等量的细胞裂解物。星号表明,与在相应实验点过度表达野生型MAPK1的细胞相比,磷酸化水平存在显著差异,具有统计学意义(p<0.05,∗∗p<0.01;学生t检验)。(B) 共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)观察显示MAPK1亚细胞定位。面板表示中心部分。对暂时表达Xpress标记野生型和三个代表性MAPK1突变体的Lenti-X 293T细胞进行检测,包括基底部(左侧)和EGF刺激5分钟后(右侧)。与野生型蛋白类似,所有突变体都位于细胞质的底部,而在EGF刺激后,它们表现出不同程度的更有效的核移位。固定细胞用抗Xpress小鼠单克隆抗体染色,然后用山羊抗小鼠Alexa Fluor-594(红色)和与绿色荧光Alexa Fuor-488染料(绿色)结合的抗卵磷脂抗体染色。DAPI染色(蓝色)显示细胞核。比例尺为10μm。图S5中报告了涉及全套突变体的图像。
图3
图3
疾病-病因地图1突变促进MAPK信号级联的可变增强刺激依赖性激活(a)MAPK1突变体的过度表达促进激酶的两种细胞质底物RSKs和MCL1的磷酸化增强,如时间过程实验所评估的。显示了三个独立实验的代表性斑点(下图)和报告平均±SD密度测定值的图表(上图)。DRS上受影响的残基映射显示为蓝色,而激活片段上的映射显示为粉红色。用所示的Xpress-tagg瞬时转染HEK293T细胞地图1构建,血清饥饿(16 h),在时间过程实验中用EGF(30 ng/mL)处理或不刺激。在10%聚丙烯酰胺凝胶上溶解等量的细胞裂解物。星号表明,与在相应实验点过度表达野生型MAPK1的细胞相比,磷酸化水平存在显著差异,具有统计学意义(p<0.05,∗∗p<0.01;学生t测试)。(B) Lenti-X 293T细胞中的荧光素酶分析。在表达MAPK1突变体的细胞中观察到EGF刺激后,报告子的诱导作用有不同程度的增强,而在非刺激状态下,转录激活活性没有差异。通过测量与pFR-Luc、pFA2-Elk1、pRL-TK-Renilla共转染的Lenti-X 293T细胞以及表达野生型或六个MAPK1突变体中的每一个的载体制备的裂解液中的荧光素酶活性来评估Elk1诱导的荧光素酶表达。每个值代表相对光单位中的荧光素酶活性,这是针对Renilla荧光素酶活性的标准化值。进行了三个独立的实验,每个实验都包括重复的样本。横线表示平均值±标准偏差。单向方差分析(p=0.0001,R平方=0.8913),然后是Bonferroni的多重比较测试(∗∗p<0.005,∗∗∗p<0.001)。
图4
图4
的后果地图1上的疾病导致变量秀丽线虫外阴发育(A)野生型和p.Asp318Gly MAPK1、野生型MPK-1(MAPK1的同源序列)的氨基酸序列,以及mpk-1型(面板14[D321G])突变体。修改后的残留物以粗体突出显示。(B)mpk-1型(面板14[D321G])(p.Asp321Gly)敲除动物表现出低渗透性多外阴(Muv)表型。在过度表达致病亚群的蠕虫中也观察到Muv的可变患病率地图1p控制下的等位基因林-31主要在外阴前体细胞(VPC)中表达。星号表示与表达地图1重量(p<0.02,∗∗p<0.01,∗∗∗p<0.0005;双尾Fisher精确测试)。(C) 突变等位基因的表达改善了携带畸形动物的外阴(Vul)表型let-23号(表皮生长因子受体)sy1型等位基因。星号表示与let-23(sy1)动物(p<0.05,∗∗∗∗p<0.00002)或从let-23(sy1)动物表达地图1重量(∗∗p<0.02,∗∗∗p<0.002,∗∗∗∗p<0.00002)。(D) Nomarski的图像显示,对照组成年雌雄同体发育正常的外阴(如上所示),而在mpk-1型(面板14[D321G])动物(见下文)。星号表示异位假外阴。(E) L3晚期/L4早期幼虫阶段外阴前体细胞(VPC)的Nomarski图像。在对照动物中,只有P6.p从角质层上脱落,形成一个对称的内陷(如上所示)。在携带mpk-1型(面板14[D321G])等位基因,显示多重不对称内陷(见下文)。该表型代表了Muv的前驱症状。黑色箭头和白色箭头分别指向正常内陷和额外内陷。在所有图像中,前部位于左侧,背部位于上方。比例尺,50μm。EV,空矢量。评分的动物数量见表S4。
图5
图5
致病性变体的位置和功能影响(A)MAPK1与来自MKP3 D基序的肽复合的结构(PDB:2FYS公司). 不同的颜色和表示突出功能重要区域。激活段,黄色;磷酸化残基Thr185和Tyr187,红色;螺旋C,浅蓝色;突变残基,半透明紫色表面;MKP3 D-motif,半透明绿色表面;MAPK1二聚体中第二单体的假定位置(根据PDB:2ERK公司),灰色表面。显示了作为DRS一部分的CD和ED域。在MAPK1/MNK1复合物(PDB:第2年第9季度)(橙色棍子)。(B) MAPK1复合物与与DRS区域相互作用的肽的结构,对应于磷酸酶MKP3(PDB:2FYS公司)和PTPN7(PDB:2GPH(2GPH)),MAPK1基板MNK1(PDB:第2年第9季度),和激酶MEK2(PDB:第4季度). 表示和颜色如上所述。与Asp318形成盐桥的相互作用肽的残基被报告为棒状。在MEK2的情况下,没有残基与Asp318形成离子对:最接近Asp318MEK2残基是Arg4,其侧链未在晶体结构中溶解,表明MAPK1-Asp318和MEK2-Arg4残基之间不存在稳定的盐桥。Arg4的假定构象已在结构中建模(细棒)。(C) 残基Ile74和Ala174在MAPK1活性和非活性结构中的位置和相互作用(PDB:2ERK公司1ERK公司)。表示和颜色如上所述。Ile74位于螺旋C上,参与两种蛋白质构象中包含激活片段残基Ala171和Val173的疏水簇。该区域在激活机制中至关重要。在活性状态下,Lys70与磷酸化的Thr185形成离子对,导致螺旋C重塑,并在保守残基Glu71和β3 Lys54之间形成更强的盐桥,这是激活的先决条件。Ala174位于激活段,并与位于催化区的Leu146相互作用。在所有情况下,残数都与人类序列相对应。
图6
图6
疾病致突变损害MAPK1与MKP3的结合,但不与MEK1结合,并在上调MAPK信号传导(A)协同免疫沉淀分析中保持对MEK活性的依赖性。瞬时转染HEK293T细胞以表达带有Myc-MEK1或Myc-MKP3的野生型和突变型Xpress-tagged MAPK1蛋白的裂解物用抗Myc抗体进行免疫沉淀,并用所示抗体进行免疫印迹分析。(B)地图1突变促进的MAPK信号上调仍依赖于MEK活性。在用MEK抑制剂曲美替尼(1.5 ng/mL,2 h)治疗后,在短暂转染的HEK293T细胞中进行MAPK、RSK和MCL1磷酸化检测,这些细胞饥饿16 h,并用EGF刺激(30 ng/mL,1 min)。印迹显示,在曲美替尼存在下过度表达野生型或突变型MAPK1蛋白的细胞中,pMAPK、pRSK和pMCL1减少,表明MAPK级联的突变驱动信号上调仍依赖于MEK活性。

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