The EGFR-ZNF263 signaling axis silences SIX3 in glioblastoma epigenetically

doi:10.1038/s41388-020-1206-7

.2020年4月；39(15):3163-3178.

doi:10.1038/s41388-020-1206-7。 Epub 2020年2月13日。

EGFR-ZNF263信号轴表观遗传沉默胶质母细胞瘤中的SIX3

于志斌^#^1 2 三, 冯建波^#^1 2, 王伟（音译）⁴, 邓志勇¹, 张燕（音译）^1 2, 兰晓², 王泽友⁵, 刘长虹^1 2, 刘青（音）⁶, Shuai Chen（帅晨）⁷, 吴明华^8 9

附属公司

¹湖南省肿瘤医院和湘雅医学院附属肿瘤医院，中南大学，长沙，410013，中国湖南。
²中南大学基础医学院肿瘤研究所、教育部致癌与肿瘤侵袭重点实验室、卫生部致癌重点实验室，湖南长沙，410078。
^三耶鲁大学免疫代谢研究所，上海交通大学医学院，上海，200025，中国。
⁴济宁医科大学附属医院病理科，济宁，272000，山东。
⁵中南大学湘雅第二医院，湖南长沙，410011。
⁶中南大学湘雅医院，湖南长沙，410008。
⁷湖南省肿瘤医院和湘雅医学院附属肿瘤医院，中南大学，长沙，410013，中国湖南。chenshuai16@139.com。
⁸湖南省肿瘤医院和湘雅医学院附属肿瘤医院，中南大学，长沙，410013，中国湖南。wuminghua554@aliyun.com。
⁹中南大学基础医学院肿瘤研究所、教育部致癌与肿瘤侵袭重点实验室、卫生部致癌重点实验室，湖南长沙，410078。wuminghua554@aliyun.com。

^#贡献均等。

PMID： 32051553
预防性维修识别码：项目管理委员会7142014
内政部： 10.1038/s41388-020-1206-7

EGFR-ZNF263信号轴表观遗传沉默胶质母细胞瘤中的SIX3

于志斌等。癌基因. 2020年4月.

.2020年4月；39(15):3163-3178.

doi:10.1038/s41388-020-1206-7。 Epub 2020年2月13日。

作者

于志斌^#^1 2 三, 冯建波^#^1 2, 王伟（音译）⁴, 邓志勇¹, 张燕（音译）^1 2, 兰晓², 王泽友⁵, 刘长虹^1 2, 刘青（音）⁶, Shuai Chen（帅晨）⁷, 吴明华^8 9

附属公司

¹湖南省肿瘤医院和湘雅医学院附属肿瘤医院，中南大学，长沙，410013，中国湖南。
²中南大学基础医学院肿瘤研究所、教育部致癌与肿瘤侵袭重点实验室、卫生部致癌重点实验室，湖南长沙，410078。
^三耶鲁大学免疫代谢研究所，上海交通大学医学院，上海，200025，中国。
⁴济宁医科大学附属医院病理科，济宁，272000，山东。
⁵中南大学湘雅第二医院，湖南长沙，410011。
⁶中南大学湘雅医院，湖南长沙，410008。
⁷湖南省肿瘤医院和湘雅医学院附属肿瘤医院，中南大学，长沙，410013，中国湖南。chenshuai16@139.com。
⁸湖南省肿瘤医院和湘雅医学院附属肿瘤医院，中南大学，长沙，410013，中国湖南。wuminghua554@aliyun.com。
⁹中南大学基础医学院肿瘤研究所、教育部致癌与肿瘤侵袭重点实验室、卫生部致癌重点实验室，湖南长沙，410078。wuminghua554@aliyun.com。

^#贡献均等。

PMID： 32051553
预防性维修识别码： 2014年7月14日
内政部： 10.1038/s41388-020-1206-7

摘要

同源异型蛋白SIX3是一种对神经发生至关重要的转录因子，具有双价启动子。我们之前的研究表明，SIX3可以通过DNA超甲基化而转录沉默，作为肿瘤抑制基因发挥作用，并通过转录抑制人类胶质母细胞瘤。在这里，我们表明表皮生长因子（EGFR）的激活通过MAPK途径诱导SIX3启动子的DNA甲基化。ERK激活后与ZNF263结合，从而消除ZNF266的泛素化并导致其稳定。ZNF263结合到SIX3的核心启动子区域，并招募KAP1/HATS/DNMT共表达复合物，通过H3K27me3和SIX3启动子甲基化诱导SIX3转录沉默。表型正常星形胶质细胞或胶质母细胞瘤细胞中EGFR-ZNF263信号轴的激活触发或增强致瘤活性，而胶质母细胞瘤组织中EGFR-ZNF263信号成分的表达升高与患者预后不良有关。总之，我们的研究结果表明，SIX3的表观遗传沉默受复杂且高度有序的致癌信号通路控制，因此为胶质母细胞瘤的发生和发展提供了新的见解。

PubMed免责声明

利益冲突声明

提交人声明他们没有利益冲突。

数字

**图1。SIX3高甲基化与人脑胶质瘤中SIX3低表达相关。**
一TCGA实验显示胶质瘤组织中的DNA甲基化水平。b条萤光素酶报告基因分析显示−294/+78（TSS = 0）是SIX3的核心启动子区域。**c（c）**RT-qPCR分析显示，5-氮杂-2-脱氧胞苷处理增强SIX3表达（左），而DNMT3A过度表达抑制SIX3的表达（右）。d日RT-qPCR和(**e（电子）**)IHC分析显示SIX3在胶质瘤和正常组织中表达*第页 < 0.05; **第页 < 0.01***第页 < 0.001.

**图2。ZNF263是SIX3的转录抑制因子。**
一SIX3启动子中推测的ZNF263结合基序。b条TCGA和REMBRANDT实验表明，胶质瘤组织中ZNF263和SIX3水平呈负相关。**c（c）**荧光素酶报告子分析显示ZNF263抑制SIX3启动子的转录活性。d日ChIP-qPCR分析显示ZNF263与SIX3启动子结合。**e（电子）**EMSA显示ZNF3在体外与SIX3启动子结合。**（f）**免疫印迹和(克)RT-qPCR分析显示ZNF263抑制SIX3表达*第页 < 0.05; **第页 < 0.01***第页 < 0.001.

**图3。ZNF263通过蛋白质-蛋白质相互作用将染色质修饰物引入SIX3启动子。**
一ChIP-qPCR分析表明，ZNF263的敲除增强了SIX3启动子中H3K9乙酰化并减弱了H3K9me3、H3K27me3。b条ChIP-qPCR分析表明，ZNF263的过度表达促进了SIX3启动子中H3K9me3和H3K27me3的富集。**c（c）**TCGA实验表明，ZNF263的表达与SIX3启动子的DNA甲基化水平呈正相关。d日MSP分析表明，ZNF263的过度表达提高了SIX3启动子的DNA甲基化水平，而ZNF266的敲除降低了DNA甲基化程度。数字表示甲基化DNA和非甲基化DNA的相对比例。**e（电子）**IP分析显示ZNF263和候选蛋白之间的相互作用。用ZNF63-FLAG和DNMT3A载体转染HEK293细胞*第页 < 0.05; **第页 < 0.01***第页 < 0.001.

**图4。MAPK通路是EGFR-介导的SIX3表观遗传沉默的主要下游效应器。**
一RT-qPCR和(b条)免疫印迹分析显示埃洛替尼治疗挽救了SIX3的表达。数字表示通过密度测定得出的相对SIX3表达。**c（c）**RT-qPCR和(d日)免疫印迹显示，用曲美替尼抑制MAPK/ERK通路可以挽救星形细胞瘤细胞中SIX3的表达，而用MK2206（AKT抑制剂）和Ruxolitinib（JAK抑制剂）治疗则无法做到这一点。**e（电子）**RT-qPCR分析表明，曲美替尼、MK2206或鲁昔单抗对ZNF263 mRNA表达影响不大。**（f）**免疫印迹显示曲美替尼治疗可特异性下调ZNF263。克免疫荧光分析表明，厄洛替尼或曲美替尼可减少ZNF263蛋白的积累，尤其是在细胞核中*第页 < 0.05; **第页 < 0.01***第页 < 0.001.

**图5。MAPK抑制通过泛素途径促进ZNF263降解。**
一免疫印迹显示用曲美替尼治疗后ZNF263蛋白的半衰期。b条全长ZNF263和ZNF263-ΔD的结构（缺少SCAN和D域）。IP实验和免疫印迹显示ERK2和ZNF263之间的相互作用，或者与ZNF266抗体相互作用(**c（c）**)或ERK2抗体(d日)用于免疫沉淀。**e（电子）**共转染ZNF263-GFP（绿色）和ERK2-RFP（红色）的HEK293细胞的典型共焦图像。合并后的图像显示ZNF263和ERK2在细胞核中的强共定位（顶部）。如箭头（底部）所示，曲美替尼治疗减少了共同定位。**（f）**IP和western blotting分析显示p-ERK1/2和ERK2与全长ZNF263蛋白结合，但与ZNF263-ΔD不结合。分别用全长ZNF263和ZNF263-ΔD载体转染U251细胞。克Western blotting显示全长ZNF263和ZNF263-ΔD蛋白经或不经曲美替尼处理的半衰期*第页 < 0.05; **第页 < 0.01***第页 < 0.001.

**图6。EGFR-ZNF263信号转轴胶质母细胞瘤细胞的功能。**
一免疫印迹显示EGFR-vIII的过度表达增加了ZNF263的表达，同时降低了SIX3的表达。在人星形细胞瘤细胞中EGFR-vIII过度表达后，敲除ZNF263或用曲美替尼治疗可恢复SIX3的表达。b条Transwell和(**c（c）**)软琼脂集落形成实验表明，敲除ZNF263、SIX3过表达或用曲美替尼治疗可减少EGFR-vIII过表达星形细胞瘤细胞的侵袭性和锚定非依赖性生长*第页 < 0.05; **第页 < 0.01***第页 < 0.001.

**图7。人胶质母细胞瘤组织中EGFR-ZNF263信号成分及其临床转归。**
一EGFR、p-EGFR（Y1173）、EGFR拷贝数变异（CNV）、ZNF263和SIX3表达的相关性分析。来自TCGA的数据。b条胶质瘤组织芯片分析中p-EGFR（Y1173）、ZNF263和SIX3的IHC染色代表性图像。**c（c）**p-EGFR（Y1173）、ZNF263与SIX3表达的关系。d日Kaplan-Meier生存曲线比较了ZNF263高表达和低表达胶质瘤患者（左）和SIX3高表达和低表达胶质瘤病人（右）的生存概率。

图8
EGFR-ZNF263信号轴表观遗传学沉默胶质母细胞瘤中的SIX3：一种模型。

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1. Dawson MA，Kouzarides T.癌症表观遗传学：从机制到治疗。单元格。2012;150:12–27.-公共医学
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