UFL1 promotes histone H4 ufmylation and ATM activation

doi:10.1038/s41467-019-09175-0

.2019年3月18日；10(1):1242.

doi:10.1038/s41467-019-09175-0。

UFL1促进组蛋白H4酰化和ATM活化

薄琴^1 2, 贾瑜², 索米拉·诺森^1 三, 王明辉⁴, 新沂涂¹, 刘桐政⁵, 李洪林⁶, 王烈伟², 镇坤楼⁷

附属公司

¹肿瘤科，梅奥诊所，罗切斯特，明尼苏达州，55905，美国。
²美国明尼苏达州罗切斯特市梅奥诊所分子药理学和实验治疗学系临床药理学部，邮编：55905。
^三美国明尼苏达州罗切斯特市梅奥诊所梅奥医学院和梅奥研究生院梅奥医学科学家培训项目，邮编55905。
⁴美国纽约州纽约市麦迪逊大道1470号西奈山伊坎医学院伊坎基因组和多尺度生物学研究所遗传学和基因组科学系，邮编：10029。
⁵暨南大学肿瘤药理学研究所，510632，广州，中国。
⁶美国佐治亚州奥古斯塔乔治亚摄政大学癌症中心生物化学与分子生物学系，邮编：30912。
⁷肿瘤科，梅奥诊所，罗切斯特，明尼苏达州，55905，美国。lou.zhenkun@mayo.edu。

PMID： 30886146
预防性维修识别码： PMC6423285型
内政部： 10.1038/s41467-019-09175-0

UFL1促进组蛋白H4酰化和ATM活化

薄琴等。国家公社. 2019.

.2019年3月18日；10(1):1242.

doi:10.1038/s41467-019-09175-0。

作者

薄琴^1 2, 贾瑜², 索迈拉·诺辛^1 三, 王明辉⁴, 新沂涂¹, 刘桐政⁵, 李洪林⁶, 王烈伟², 镇坤楼⁷

附属公司

¹美国明尼苏达州罗切斯特市梅奥诊所肿瘤科，邮编55905。
²美国明尼苏达州罗切斯特市梅奥诊所分子药理学和实验治疗学系临床药理学部，邮编55905。
^三美国明尼苏达州罗切斯特市梅奥诊所梅奥医学院和梅奥研究生院梅奥医学科学家培训项目，邮编55905。
⁴美国纽约州纽约市麦迪逊大道1470号西奈山伊坎医学院伊坎基因组和多尺度生物学研究所遗传学和基因组科学系，邮编：10029。
⁵暨南大学肿瘤药理学研究所，510632，中国广州。
⁶美国佐治亚州奥古斯塔乔治亚摄政大学癌症中心生物化学与分子生物学系，邮编：30912。
⁷肿瘤科，梅奥诊所，罗切斯特，明尼苏达州，55905，美国。lou.zhenkun@mayo.edu。

PMID： 30886146
预防性维修识别码： PMC6423285型
内政部： 10.1038/s41467-019-09175-0

摘要

共济失调-扩张突变（ATM）激酶是DNA损伤反应（DDR）的上游激酶，在DNA损伤后迅速激活，并磷酸化其下游靶点以启动DDR信号。然而，ATM激活的机制仍不完全清楚。在这里，我们报道了UFM1特异性连接酶1（UFL1），一种ufmylation E3连接酶，对ATM激活很重要。在DNA损伤后，UFL1被MRE11/RAD50/NBS1复合物和单脲酰化物组蛋白H4招募用于双链断裂。单脲酰化组蛋白H4对Suv39h1和Tip60的招募很重要。此外，ATM在丝氨酸462处磷酸化UFL1，增强UFL1 E3连接酶活性并促进ATM在正反馈回路中的激活。这些发现表明，UFL1对组蛋白H4的酰化是扩增ATM激活和维持基因组完整性的重要步骤。

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作者声明没有相互竞争的利益。

数字

图1
UFL1蛋白通过MRN复合物在DSB聚集。一用多西环素（Dox）处理在shRNA上稳定表达UFL1 Tet的U2OS细胞3-5天，然后用或不用2 30后的Gy IR min，收集细胞并用NETN缓冲液溶解。细胞裂解物与UFL1抗体孵育 + 苯甲酸酶。免疫沉淀用指示的抗体进行了印迹。b条红外辐射U2OS细胞中UFL1和γH2AX的免疫荧光 Gy）。**c（c）**曲安奈德（TA）处理诱导RFP-I-SceI-GR融合蛋白从细胞质转移到细胞核，并在切割部位产生一条双链断裂。用指示抗体检测蛋白定位。d日0.5后不同时间点UFL1焦点形成 Gy IR处理。**e（电子）**,如果在Mre11敲除细胞或*国家统计局1*缺陷细胞（NBST）。克用Vector（V）或Flag-NBS1转染NBST细胞，并用或不用2 30后的Gy IR 分钟后，对细胞进行裂解，并用UFL1抗体和苯甲酸酶进行免疫沉淀。免疫沉淀用指示的抗体进行了印迹。小时NBS1蛋白结构域示意图。我U2OS细胞用或不用2 Gy IR，细胞裂解物被GST、GST-NBS1 FHA+BRCT（1+2）蛋白拉下。清洗后，将珠子煮沸，并用指示的抗体进行分析。比例尺，10 微米。源数据作为源数据文件提供

图2
UFL1调节ATM信令。一用2 Gy-IR。30分钟后，裂解细胞并用指示的抗体进行印迹。b条γH2AX、53BP1和BRCA1病灶对照（Dox-）和UFL1敲除（Dox+）U2OS细胞1的代表性图片 0.5小时后 Gy治疗。比例尺，10 微米。**c（c）**——**e（电子）**对照（Dox-）和UFL1敲除（Dox+）U2OS细胞中γH2AX、53BP1和BRCA1病灶强度的定量。以平均值表示的数据 ± 第个SD，共个n个 = 50个单元格**第页 < 0.01（按学生）t吨-测试。源数据作为源数据文件提供

图3
UFL1调节DNA损伤反应。一——d日用强力霉素处理与HR或NHEJ报告子整合并感染UFL1-Tet-on shRNA1和shRNA2病毒的U2OS细胞，并按照方法进行HR和NHEJ分析。数据表示为的平均值±SDn个 = 3个生物复制*第页 < 0.05, **第页 < 0.01. 使用Student计算统计显著性t吨-测试。**e（电子）**,如果对稳定表达UFL1-Tet-on shRNA1和shRNA2的U2OS细胞进行IR后的集落形成分析，包括是否使用强力霉素（Dox）。数据表示为n个 = 3个独立实验*第页 < 0.05, **第页 < 0.01. 使用双向方差分析计算统计显著性。克用2 Gy IR。30分钟后，用所示抗体溶解细胞并进行印迹。小时UFSP2-标记或载体质粒转染U2OS细胞。24 h后，用2 Gy IR和细胞裂解物用指示的抗体进行印迹。源数据作为源数据文件提供

图4
UFL1单脲酰化组蛋白H4并促进ATM激活。一通过质谱法从辐照的293T细胞中鉴定出表达Flag-His载体或Flag-His-UFM1的选定蛋白质。N个 = 每组分析1个样本。已识别蛋白质的完整列表见补充数据1。在组蛋白中，与Flag-His纯化（6个独特肽/7个总肽）相比，Flag-His-UFM1纯化中只有H4富集（9个独特肽/20个总肽类），这表明H4可能被酰化。b条在IR（2 Gy）用镍珠和反旗琼脂糖纯化后。用指定的抗体检测免疫沉淀物。**c（c）**从含有或不含有2 Gy IR并用指示的抗体进行印迹。d日体外甲酰化试验。纯化的UBA5、UFC1、UFL1、UFM1和H4蛋白在ATP和MgCl的存在下一起培养₂30时^°C代表90 min.用指示的抗体探测反应产物。**e（电子）**将野生型组蛋白H4和11个不同的单赖氨酸（K）到精氨酸（R）突变体转染到U2OS细胞。进行Flag和His串联纯化，并分析H4甲酰化。如果将表达WT或K31R H4的构建体转染到UFL1 shRNA表达细胞上的U2OS tet中，并如所示用多西环素处理细胞。2点后30分钟 Gy IR，收集细胞并用指示的抗体进行印迹。克IR后表达WT H4或H4K31R的U2OS细胞的集落形成 ± s.e.m.用于n个 = 3个独立实验。使用双向方差分析计算统计显著性*第页 < 0.05, **第页 < 0.01.小时用多西环素（Dox）处理稳定表达UFL1-Tet-on shRNA的U2OS细胞，并用2 30分钟后，收集细胞。一半的细胞被裂解。从另一半细胞中分离出染色质组分。样本用指示的抗体进行了印迹。源数据作为源数据文件提供

图5
组蛋白H4的Ufm化增强了H3K9在DSB的三甲基化。一,b条通过染色质IP（ChIP）分析MDA-MB-231 ROS8细胞DSB位点的H3K9三甲基化和Suv39H1募集，并进行指定处理。这个年-轴表示与输入相比，目标蛋白结合DNA的相对富集。UFL1 shRNA（非诱导shRNA）的靶序列一与诱导sh2相同。所提供的数据是平均值 ± s.e.m.用于n个 = 3个独立实验**第页 < 0.01. 使用单因素方差分析计算统计显著性。源数据作为源数据文件提供

图6
ATM磷酸化UFL1并增强其活性。一U2OS细胞中表达Flag-UFL1。在载体或ATM抑制剂KU55933处理后，用IR照射细胞。对Flag-UFL1进行免疫沉淀，并用磷酸-SQ/TQ抗体和Flag抗体探测印迹。b条Flag-UFL1表达于*自动取款机*+/+或*atm−/−*MEF细胞。用IR照射细胞，然后按照一.c（c）U2OS细胞中表达Flag-UFL1或S462A突变体。用或不用10 Gy IR。30分钟后，用Flag抗体结合的琼脂糖珠溶解细胞并培养。免疫沉淀用磷酸化SQ/TQ抗体和Flag抗体进行印迹。d日用或不用2 Gy-IR并用指示的抗体固定和染色。比例尺，10 微米。**e（电子）**用10 Gy IR。30分钟后，从细胞中纯化UFL1 WT和S462A突变体，并与纯化的UBA5、UFC1、UFL1、UFM1和H4蛋白在30℃孵育 ^°C代表90 min.通过用所示抗体探测印迹来评估反应。如果His-UFM1在ATM阳性或缺陷细胞中表达。在变性条件下纯化His-UFM1结合蛋白。纯化的样品用指示的抗体进行了印迹。克标记的UFL1或S462A突变体在U2OS细胞中表达。在IR后的指定时间点采集细胞，并用指定抗体进行印迹。小时用WT UFL1或S462A突变体重组的UFL1缺失细胞进行IR后的集落形成分析。数据表示为n个 = 3个独立实验。点表示单个数据点。使用双向方差分析计算统计显著性***P（P）* < 0.01. 源数据作为源数据文件提供

图7
UFL1激活ATM的模型。当DNA损伤发生时，UFL1被MRN复合物和单脲酰化物组蛋白H4招募，从而将SUV39H1招募到DSB中，以使H3K9三甲基化，从而形成H3K9me3。Tip60与H3K9me3结合，乙酰化ATM，并促进ATM激活。C-Abl还磷酸化Tip60并增强Tip60乙酰转移酶活性。激活的ATM磷酸化Ser462上的UFL1，并增强其活性，从而放大ATM激活信号并形成正反馈回路

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[2] Harper JW，Elledge SJ。DNA损伤反应：十年后。分子细胞。2007;28:739–745. doi:10.1016/j.molcel.2007.11.015。-内政部-公共医学

[3] Shiloh Y，Ziv Y。ATM蛋白激酶：调节细胞对基因毒性应激的反应等。自然修订版分子细胞生物学。2013;14:197–210. doi:10.1038/nrm3546。-内政部-公共医学

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[6] 莱因哈特HC，亚菲MB。控制细胞周期以应对DNA损伤的激酶：Chk1、Chk2和MK2。货币。操作。细胞生物学。2009;21:245–255. doi:10.1016/j.ceb.2009.01.018。-内政部-项目管理咨询公司-公共医学

[7] Lavin MF，Shiloh Y.共济失调-扩张症的遗传缺陷。每年。免疫学版。1997;15:177–202. doi:10.1146/annurev.immuniol.15.1.177。-内政部-公共医学

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[9] Kastan MB，Lim DS，Kim ST，Yang D.ATM——多细胞对辐射反应的关键决定因素。《Oncol学报》。2001;40:686–688. doi:10.1080/02841860152619089。-内政部-公共医学

[10] Kastan MB，Lim DS，Kim ST，Yang D.ATM——多细胞对辐射反应的关键决定因素。《Oncol学报》。2001;40:686–688. doi:10.1080/02841860152619089。-内政部-公共医学

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