Suppression of Hepatitis C Virus Genome Replication and Particle Production by a Novel Diacylglycerol Acyltransferases Inhibitor

doi:10.3390/molecules23082083

.2018年8月20日；23(8):2083.

doi:10.3390/分子23082083。

新型二酰甘油酰基转移酶抑制剂抑制丙型肝炎病毒基因组复制和颗粒生成

附属公司

¹韩国高阳东国大学药学院，10326。gkdlfnwhel@nate.com。
²韩国首尔02841，韩国大学生命科学与生物技术学院。lighthil@gmail.com。
³韩国高阳东国大学药学院，10326。aldlf998@dongguk.ac.kr。
⁴韩国高阳东国大学药学院，10326。flatronsky@gmail.com。
⁵韩国高阳东国大学药学院，10326。ryche99@naver.com。
⁶肝炎研究实验室，应用分子病毒学系，韩国巴斯德研究所，696，Seongnam 13488，韩国。thoa.than@ip-korea.org。
⁷肝炎研究实验室，应用分子病毒学系，韩国巴斯德研究所，696，Seongnam 13488，韩国。phuong.nguyen@ip-korea.org。
⁸肝炎研究实验室，应用分子病毒学系，韩国巴斯德研究所，696，Seongnam 13488，韩国。marc.windisch@ip-korea.org。
⁹韩国高阳东国大学药学院，10326。kaylee@dongguk.edu。
¹⁰韩国首尔02841，韩国大学生命科学与生物技术学院。ychoi@korea.ac.kr。
¹¹韩国高阳东国大学药学院，10326。lkj640@gmail.com。

PMID： 30127285
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内政部： 10.3390/分子23082083

新型二酰甘油酰基转移酶抑制剂抑制丙型肝炎病毒基因组复制和颗粒生成

Dahee Kim公司等。分子. 2018.

.2018年8月20日；23(8):2083.

doi:10.3390/分子23082083。

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¹韩国高阳东国大学药学院，10326。gkdlfnwhel@nate.com。
²韩国首尔02841，韩国大学生命科学与生物技术学院。lighthil@gmail.com。
³韩国高阳东国大学药学院，10326。aldlf998@dongguk.ac.kr。
⁴韩国高阳东国大学药学院，10326。flatronsky@gmail.com。
⁵韩国高阳东国大学药学院，10326。ryche99@naver.com。
⁶肝炎研究实验室，应用分子病毒学系，韩国巴斯德研究所，696，Seongnam 13488，韩国。thoa.than@ip-korea.org。
⁷韩国巴斯德研究所应用分子病毒学系肝炎研究实验室，696，Seongnam 13488，韩国。phuong.nguyen@ip-korea.org。
⁸肝炎研究实验室，应用分子病毒学系，韩国巴斯德研究所，696，Seongnam 13488，韩国。marc.windisch@ip-korea.org。
⁹韩国高阳东国大学药学院，10326。kaylee@dongguk.edu。
¹⁰韩国首尔02841，韩国大学生命科学与生物技术学院。ychoi@korea.ac.kr。
¹¹韩国高阳东国大学药学院，10326。lkj640@gmail.com。

PMID： 30127285
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摘要

二酰甘油酰基转移酶（DGAT）在肝脏内源性甘油三酯（TGs）的生物合成和脂滴（LDs）的形成中起着关键作用。特别是，据报道，DGAT的一个成员DGAT-1是高效生产丙型肝炎病毒（HCV）颗粒的重要宿主因子。通过利用我们之前描述的三组不同的十二种DGAT抑制剂，我们发现其中一种DGAT抑制剂是2-（（4-金刚苯氧基）甲基）-N个-（呋喃-2-基甲基）-1H（H）-苯并[d]咪唑-5-羧基(10焦耳)是HCV基因组复制和颗粒生成的有效抑制剂。10焦耳能够以相互独立的方式诱导对这两种关键病毒功能的抑制。病毒基因组复制的消减10焦耳导致病毒蛋白表达显著降低。有趣的是，我们发现其抗病毒效果并不依赖于通过以下途径减少TG生物合成10焦耳这表明10焦耳对抗DGAT可能与其抗病毒作用没有直接关系。

关键词：DGAT抑制剂；丙型肝炎病毒基因组复制；HCV颗粒生产；二酰甘油酰基转移酶（DGAT）；丙型肝炎病毒；脂滴（LD）。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

数字

图1
**10焦耳**导致HCV复制和颗粒生成同时受阻。用12种DGAT抑制剂在10μM浓度下处理Huh7.5-J6/JFH1细胞(A类)6小时和(C类)72 h后，通过实时RT-PCR分析测定HCV和GAPDH RNA水平。从化合物处理的Huh7.5-J6/JFH1细胞收集上清液，用于(B类)6小时和(D类)与原始Huh7.5细胞孵育72小时，通过另一轮实时RT-PCR分析测量其感染性。

图2
**10焦耳**以机械分离的方式同时阻断HCV复制和颗粒生成(A类)Huh7.5-J6/JFH1细胞用浓度增加的**10焦耳**在指定的时间段内（3、6、12、24、48和72小时）。然后，提取它们的总RNA，并通过实时RT-PCR分析测量细胞内HCV RNA水平。(B类)同时，从**10焦耳**-处理后的Huh7.5-J6/JFH1细胞与原始Huh7.5细胞孵育，通过另一轮实时RT-PCR分析测定其感染性。(C类)欧盟委员会₅₀HCV基因组复制和颗粒产生的数值是根据(A类,B类). (D类,E类)进行了与中相同的实验(A类,B类)通过使用**A922500型**除培养3小时外。(F类)欧盟委员会₅₀HCV基因组复制和颗粒产生的数值是根据(D类,E类).

图3
**10焦耳**在无报告系统中抑制HCV复制。(A类)剂量-以及(B类)时间相关效应**10焦耳**通过实时RT-PCR分析Huh7.5-J6/JFH1细胞，通过测量相对HCV和GAPDH RNA水平，确定基因型2a的HCV基因组复制(C类)剂量-以及(D类)时间相关效应**10焦耳**通过对Huh7.5-Bart79I细胞进行实时RT-PCR分析，测量相对HCV和GAPDH RNA水平，确定1b型HCV基因组复制。(E类)对Huh7.5-J6/JFH1细胞进行一系列增加浓度的**10焦耳**72小时后，用蓝色的DAPI染色细胞作为细胞核，用绿色的抗J2抗体染色dsRNA，用红色的Oil-red-O染色LD。(F类)dsRNA和油红O信号的定量如图3E所示。

图4
**10焦耳**HCV生命周期后期需要。(A类)添加时间实验的示意图。在HCVcc（（a）表达NS5A-GFP的JFH1病毒）感染**10焦耳**在不同浓度下或与1%二甲基亚砜（化合物的溶剂）、肝素（2μg/mL）或索非布韦（10μM）（（a）预处理），或（b）与HCVcc联合治疗，或在HCVccs感染后2小时后治疗（c）。(B类)感染后72小时，通过计算GFP阳性细胞的数量来测量HCVcc感染。第页-数值用星号表示(**第页< 0.01); 不重要（未另行规定）。(C类)通过剂量-反应曲线分析测定抗病毒活性。(D类)用HCVcc感染Huh7.5细胞，并用增加浓度的**10焦耳**72小时后，使用GFP抗体通过western blot分析定量NS5A-GFP蛋白的表达。

图5
**10焦耳**降低HCV蛋白的表达水平。(A类)用浓度增加的**10焦耳**通过测量HCV NS3相对于β-肌动蛋白。采用NS5A抑制剂Daclatasvir作为阳性对照。(B类)J6/JFH1 RNA转染的Huh7.5细胞经8μM10焦耳通过测量HCV NS3相对于β-肌动蛋白。(C类,D类)进行了与中相同的实验(A类,B类)研究**10焦耳**Huh7.5-Bart79I细胞NS5A蛋白的表达水平呈剂量和时间依赖性。

图6
**10焦耳**抑制TG生物合成(A类)Huh7.5细胞用10μM的二甲基亚砜或**10焦耳**，或20μM922500美元72小时后，用TG定量分析试剂盒定量内源性TG水平。(B类)Huh7.5细胞用8μM的二甲基亚砜或**10焦耳**，或20μMA9922500号72h后，用BODIPY和DAPI分别对Huh7.5细胞进行染色，以显示LDs和细胞核。(C类)使用Image J软件量化图1B中所示的LD水平。(D类)J6/JFH1 RNA转染的Huh7.5细胞用二甲基亚砜或8μM10焦耳对J6/JFH1 RNA转染的Huh7.5细胞进行BODIPY染色或不染色，并进行FACS分析。单个星号（*）表示第页-值介于0.1和0.5之间。三个星号（***）表示第页-值小于0.01。(E类)剂量依赖性抑制体外甘油三酯合成**10焦耳**将DGAT-1表达质粒转染到293T细胞中。然后，从这些转染的293T细胞中分离出含有DGAT-1酶的膜组分。膜组分与荧光标记的NBD-棕榈酰辅酶a混合。新合成的TG的量通过TLC板在增加**10焦耳**.

图7
(A类)用增加浓度的**10焦耳**72h后，用红色的抗NS3抗体对细胞进行染色，用蓝色的DAPI标记细胞核，用BODIPY标记LD。(B类)从图6A所示实验的三张以上图像中量化NS3和BODIPY阳性细胞的相对百分比。(C类)将Huh7.5-JFH1-5A-GFP细胞用浓度增加的**10焦耳**72h。NS5A用绿色显示细胞，细胞核用蓝色显示DAPI，LD用油红O。(D类)从图6C所示实验的三张以上图像中量化NS3-GFP-和LD-阳性细胞的相对百分比。(E类)的影响**10焦耳**HCV IRES相关翻译。将HCV IRES荧光素酶报告质粒转染Huh7.5细胞，然后增加浓度**10焦耳**HCV IRES依赖性翻译效率通过荧光素酶分析测定。

图8
**10焦耳**不会改变肝脏特异性标记物（如HNF4α和miR122）的水平。对Huh7.5-J6/JFH1细胞进行一系列增加浓度的**10焦耳**持续72小时(A类)通过western blot分析，HNF4α蛋白相对定量为β-肌动蛋白。(B类)miR122在浓度增加的情况下通过RT-PCR分析进行相对定量**10焦耳**在Huh7.5-J6/JFH1细胞中。

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