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.2018年6月1日;293(22):8394-8409.
doi:10.1074/jbc。RA117.001078。 Epub 2018年4月4日。

促炎蛋白HMGB1是转谷氨酰胺酶-2的底物,与自身抗原形成高分子量复合物

附属公司

促炎蛋白HMGB1是转谷氨酰胺酶-2的底物,与自身抗原形成高分子量复合物

威廉·L·威利斯等。 生物化学杂志. .

摘要

高机动性组蛋白1(HMGB1)是一种染色质相关蛋白,在应激或损伤时,它会从细胞核转移到细胞外环境,在细胞外环境中起到警报蛋白的作用。HMGB1的功能部分取决于它与其他分子形成的络合物(HMGB1c)。然而,HMGB1多肽中可能调节HMGB1c形成的结构修饰以前没有描述过。在本报告中,我们在系统性红斑狼疮(SLE)患者的血浆和外周血单个核细胞中观察到了高分子量、抗变性HMGB1c,在健康受试者中观察到的情况要少得多。在内毒素或免疫佐剂明矾诱导的小鼠组织和培养细胞中也检测到HMGB1c的差异水平。值得注意的是,我们发现HMGB1c的形成是由蛋白交联酶转谷氨酰胺酶-2(TG2)催化的。交叉位点定位和MS分析表明HMGB1可以与TG2以及其他一些蛋白质交联,包括人类自身抗原。这些发现对SLE和其他自身免疫性疾病的细胞应激反应和先天免疫的研究具有重要的功能意义。

关键词:自身免疫性疾病;自身免疫;钙;高迁移率组盒1;脂多糖;蛋白质交联;系统性红斑狼疮;转谷氨酰胺酶。

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利益冲突声明

作者声明,他们与本文的内容没有利益冲突。内容完全由作者负责,不一定代表国家卫生研究院的官方观点

数字

图1。
图1。
SLE患者的血浆和PBMC中存在高分子量HMGB1复合物。 A类,SDS-PAGE,然后用HMGB1抗体进行免疫印迹,比较健康人血浆样本中的HMGB1(n个=3)和SLE患者(n个= 4). HMGB1(29 kDa)和高分子量HMGB1复合物(HMGB1c)被描述为相同印迹的低曝光和高曝光(完整印迹曝光如图S1). 蛋白质膜最初用Ponceau S染色以显示蛋白质负载(右侧面板).B类,血浆样本A类SDD-AGE凝胶分离,HMGB1免疫印迹显示SLE相关HMGB1c。用Ponceau S染色的蛋白膜显示出相当的蛋白负载量(右侧面板).C类SDS-PAGE免疫印迹显示,与健康对照组相比,四名SLE患者中有三名患者的PBMC中富含HMGB1c。用β-肌动蛋白孵育膜,并用Ponceau S进行初步染色,显示出相当的蛋白质负载量。D类LPS在PBMC中诱导HMGB1和HMGB1c。图中所示为在每条车道顶部指示的时间间隔内用溶媒(对照)或LPS(100 ng/ml)刺激人PBMC蛋白裂解物的免疫印迹,并用HMGB1抗体进行探测(顶部面板). 凝胶HMGB1c区域的较长暴露时间如图所示中央面板,GAPDH位于底部面板。E类,HMGB1c由LPS刺激RAW 264.7细胞诱导。用载体(NT)或LPS(100 ng/ml)刺激细胞达到指定时间,并在低渗缓冲液中溶解以获得细胞溶质提取物。蛋白裂解物的免疫印迹显示细胞溶质HMGB1c的时间依赖性增加,凝胶顶部出现额外的缓慢迁移HMGB1b(车道6).F类明矾在小鼠巨噬细胞样细胞系RAW 264.7中以浓度依赖的方式诱导HMGB1c。图中所示为用不同浓度明矾孵育6小时的总细胞裂解物的免疫印迹分析,显示在每条泳道的顶部。作为阳性对照,用LPS(100 ng/ml)刺激细胞24小时D——F是具有类似结果的三到四个独立实验的代表。
图2。
图2。
LPS诱导小鼠HMGB1c和TG2,明矾诱导单核细胞HMGB1c2。向BALB/c小鼠腹腔注射LPS(2 mg/kg)(n个=3–4/组)。A–D、组织、脾脏(A类)和肝脏(B–D类)在LPS注射后0、2和24小时收获,裂解,并使用指示的抗体进行免疫印迹分析。C–E类,HMGB1c信号强度B类标准化为GAPDH,并描述为样本平均值和标准偏差的散点图误差线(*,第页=0.02C类; *,第页=0.004D类).E类刺激2h后,免疫组化和共聚焦显微镜下的小鼠肝脏显示LPS诱导HMGB1核-胞质易位,与TG2明显共定位(比例尺= 30 μ).DAPI公司,4′,6-二氨基-2-苯基吲哚。
图3。
图3。
TG2与HMGB1结合并催化HMGB1c的形成。 A类B类用mCherry-HMGB1质粒构建物转染人肾293T细胞(mch-HMGB1)、TG2-GFP或两者(Co-Tx公司)然后在24小时用共焦显微镜进行分析(A类)以及通过细胞总裂解物的Western blotting(B类). 在一些样品中,转染细胞与离子霉素孵育(离子, 5 μ90分钟)。R(右),红色;G公司,绿色;驾驶员信息中心,差分干涉对比度;DAPI公司,4′,6-二氨基-2-苯基吲哚。不适用,未转染。C类共免疫沉淀实验显示HMGB1和TG2相互作用。用GFP-HMGB1构建物转染293T细胞(G-H公司)或载体控制(仅GFP)并在24小时收获。将总细胞裂解物与GFP抗体耦合到磁性琼脂糖珠培养30分钟并清洗。左侧面板SDS-PAGE分析输入物和洗脱液的银染。使用GFP抗体用洗脱液进行免疫印迹(中央面板)和TG2抗体(右侧面板).D类,重组HMGB1是TG2底物。rHMGB1,a他的6-HMGB1融合蛋白产生于大肠杆菌,与不同浓度的猪TG2在37°C下在补充Ca的反应缓冲液中孵育60分钟2+(5米). 通过添加SDS负载缓冲液终止反应,并用HMGB1抗体进行Western印迹。E类,内源性HMGB1是TG2底物。总RAW 264.7细胞裂解物与TG2(0.2毫单位/μl)在有钙或无钙的情况下孵育2+(5米)和胱胺(10米)如图所示,持续1h,然后用HMGB1抗体进行免疫印迹。Western blot分析表明钙激活TG22+诱导了HMGB1c的形成,而胱胺对TG2的抑制抑制了HMGB2c的形成。F类siRNA敲低TG2抑制HMGB1c的形成。用TG2靶向siRNA转染人肺成纤维细胞(TG2型,25牛顿)或加扰控制(紧急停堆,100牛顿). 72小时后,这些细胞连同未转染或模拟转染的细胞(M(M))仅暴露于转染试剂的细胞,用HMGB1抗体进行Western blotting分析。G公司,用封闭肽确认HMGB1抗体对HMGB1c的特异性。HMGB1免疫印迹在不存在的情况下培养(左侧面板)或存在(右侧面板)用于提高HMGB1抗体的合成肽。(车道1,重组HMGB1;车道2,HMGB1c,通过向细胞裂解液中添加重组HMGB1进行催化;车道34小鼠肝脏内源性HMGB1和HMGB1c(车道3)和人肺成纤维细胞裂解物(车道4). 所示数据代表三个或更多独立实验。
图4。
图4。
通过底物掺入分析鉴定和绘制HMGB1交联位点。使用两种表征良好的生物素化TG2底物(BP和A25)作为亲和探针进行底物掺入测定。A类D类,rHMGB1在TG2和BP或A25肽存在或不存在的情况下孵育1h,在SDS-PAGE凝胶上进行尺寸分馏,并使用HMGB1抗体进行免疫印迹分析(A类)或N-HRP(D类).工作分解结构,蛋白质印迹。B类C类,一个蛋白质区域(波段1,由表示在里面A类,车道3)使用MassMatrix数据库搜索软件从凝胶中切除,用于串联质谱分析和随后的交联映射。B类,数据库搜索检测到的交联被描述为概率图,其中每个细胞代表一个潜在的ϵ-(γ-谷氨酰)赖氨酸异肽键。波段1与HMGB1抗体反应,含有TG2-HMGB1交联,其中HMGB1 Lys-44和Lys-68与TG2的Gln-636形成异肽键。C类,交联映射汇总表如所示B类除HMGB1和TG2交联外,在波段1表明TG2与自身形成交联。E类G公司HMGB1是TG2赖氨酸供体底物,在多个位点交联到A25。波段3D类,车道5从凝胶中切除(E类)交联图谱显示A25与许多赖氨酸交联,其中一些位于HMGB1 NLS区域。F类G公司HMGB1的NLS1或NLS2中存在的Lys供体总结如下F类HMGB1中的蛋白质如图所示G公司中描述的污点A类D类代表了从三个独立实验中获得的数据。
图5。
图5。
用质谱法分离和鉴定TG2介导的HMGB1交联蛋白。 A类B类,NIH-3T3细胞裂解物增强TG2介导的HMGB1交联。猪TG2与rHMGB1(His6-HMGB1)补充,无(A类)或使用NIH3T3细胞裂解物(B类). 反应混合物在60分钟间隔内取样,在SDS-PAGE上进行分级,并使用抗-His抗体进行免疫印迹分析。C类D类因此,TG2与NIH-3T3细胞裂解物和(C类)和没有(D类)将反应混合物在钴柱上纯化,以分离HMGB1-和HMGB1-交联蛋白。样品通过SDS-PAGE进行解析,并使用HMGB1抗体进行免疫印迹分析(左侧面板)和Ponceau S染色(右侧面板).,输入;E类,洗脱液;佛罗里达州,流通。E类,通过质谱法鉴定并使用PANTHER基因本体搜索工具进行基因本体分析的与rHMGB1交联的蛋白质的功能分类。F类HMGB1相关蛋白是自身抗原。所示数据代表四个(A类B类)或三个(C–F类)独立实验。

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引用人

工具书类

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