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.2018年3月22日；9(1):1188.
doi:10.1038/s41467-018-03523-2。

AP-MS和BioID兼容的MAC标签能够全面绘制蛋白质相互作用和亚细胞定位

刘晓楠 1 2, 卡里·萨洛卡斯 1 2, Fitsum Tamene公司 1 2 三, 亚明酒 1 2, Rigbe G Weldatsadik公司 1 2 三, 蒂娜·赫曼 1 2 三, 马尔库·瓦尔乔萨洛 4 5 6
附属公司

与AP-MS和BioID兼容的MAC标签能够全面映射蛋白质相互作用和亚细胞定位

刘晓楠等。 国家公社. .

摘要

蛋白质之间的相互作用几乎支配着所有的细胞功能。这些稳定和瞬态关联的复杂网络可以通过亲和纯化质谱（AP-MS）和互补的基于邻近性的标记方法（如BioID）绘制。为了利用这两种策略的优势，我们在这里设计并优化了一种将AP-MS和BioID结合在一个结构中的集成方法，我们称之为MAC标签。我们系统地将MAC-tag方法应用于18个亚细胞和3个亚细胞器定位标记，生成了一个分子上下文数据库，可用于定义蛋白质的分子位置。此外，我们表明，结合AP-MS和BioID结果可以获得蛋白质复合体内的相互作用距离。综上所述，我们的综合策略能够全面映射蛋白质的物理和功能相互作用，定义其分子背景并提高我们对细胞相互作用组的理解。

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作者声明没有相互竞争的利益。

数字

图1
图1
基于MAC-tag的工作流程，用于识别蛋白质复合物和相互作用。包含StrepIII、HA和BirA*的网关兼容MAC-tag目的载体设计为允许感兴趣的基因进行C末端或N末端标记。然后将表达载体转染到T-REx 293中的Flp-In中，建立稳定且可诱导表达的转基因等基因细胞系。对于AP-MS和BioID分析方法，将细胞系分离为两种培养物，BioID细胞接受50 μM生物素在其培养基中。在接下来的蛋白质提取过程中，使用了两种分析方法的优化裂解和亲和纯化条件。然后通过定量质谱分析相互作用蛋白，并通过严格的统计过滤推断出高置信度相互作用蛋白（HCIPs）。这种集成的工作流程允许轻松生成用于分析的细胞材料，并对形成的蛋白复合物进行综合观察，蛋白质相互作用和详细的分子上下文定义
图2
图2
细胞定位标记的荧光显微镜分析。使用Alexa Fluor 488标记的抗-HA免疫染色（绿色）、其与Alexa Fuor 594链霉亲和素（红色）的体内生物素化相互作用物以及与DAPI（蓝色）的细胞核进行免疫荧光染色，显示与MAC-tag融合的18个亚细胞定位标记（比例尺：10 微米）
图3
图3
为真正的细胞标记生成全面的相互作用组图。我们对18个定位标记进行了综合分析，从AP-MS中识别出679个HCI，从BioID分析中识别出2118个HCI。一18个真正的亚细胞器/结构标记中已知（蓝色）和新识别（红色）相互作用的数量分布说明了系统分析的必要性。b条通过AP-MS或BioID纯化方法，每个定位标记的相互作用数量分布显示出与单独使用这些方法的其他出版物相似的连接性分布。方框图显示了Tukey胡须的中位数、第25和第75百分位（中位数 ± 1.5IQR）。c（c）,d日蛋白酶体细胞器标记（PSA1）和核膜（LMNA）的蛋白质相互作用网络和分子背景。从AP-MS（绿线）和BioID（黄线）中识别出的HCI与已知的捕食相互作用（灰色虚线）一起显示。节点根据从CellWhere数据库获得的本地化等级进行颜色编码（键：深绿色 = 对应蛋白淡绿色的初级细胞定位 = 可能的定位，灰色 = 蛋白质定位不同或没有定位）。维恩图强调了AP-MS和BioID方法的互补性。e（电子）18个亚细胞细胞器/结构的参考分子背景图。BioID分析中唯一的高置信度相互作用物围绕相应的定位标记排列成一个圆圈，共享的相互作用物以代表多个定位的相应颜色显示。具有四个以上亚细胞定位的猎物显示为灰色。新识别的相互作用显示在粉红色边缘，已知的相互作用以蓝色显示
图4
图4
使用参考分子背景图进行分子水平定位映射。一利用我们的参考相互作用上下文评估查询的蛋白质定位的MS显微镜方法的示意图概述。b条极坐标图显示了MS显微镜观察到的查询蛋白的位置。每个扇区代表我们的参考数据库定义的一个亚细胞位置。分配给每个本地化的颜色基于注释频率（粉色：0–0.5；黄色：0.5–0.75；绿色：0.75–1）。c（c）,d日分别显示了从BioID和AP-MS获得的PPI网络。通过CellWhere数据库验证了猎物蛋白的定位。节点颜色方案协调图4b中的观测定位
图5
图5
AOX定位于线粒体内膜和复合物II附近。一来自的AOX肠纤毛虫被引入人类细胞，MS显微镜将AOX定位于线粒体。b条基于CellWhere数据库，BioID方法识别出333种相互作用，其中93.1%（310）为线粒体（绿色），0.3%（1）为过氧化物酶体（粉红色），6.6%（22）为未分配（灰色）。c（c）共有38个相互作用物是线粒体呼吸链复合物的组成部分（复合物I-V，关键：颜色梯度表示所识别的每个复合物的蛋白质百分比）。d日平均组分丰度表明AOX与复合物II关联最大，这与AOX建议的功能作用一致。方框图显示了中间值，即25第个和75第个百分位，Tukey胡须（中位数 ± 1.5IQR）和异常值（.）
图6
图6
线粒体的亚阶分子背景图。一线粒体可分为四个隔室，即线粒体外层膜（深绿色）、线粒体内部空间（浅绿色）、内线粒体膜（灰色）和线粒体基质（黄色）。b条三种线粒体蛋白，TOM20、SCO1和PDK1，用于生成线粒体亚细胞器分子背景图，其PPI网络来自BioID（关键：相互作用的蛋白质根据其相应的诱饵线粒体位置着色。已知（蓝色），新识别（红色）和猎物（黑色虚线）的相互作用是彩色编码的）。c（c）共焦显微镜分析无法提供线粒体蛋白质的亚细胞器水平信息，而MS显微镜允许在线粒体隔室中分配蛋白质。共聚焦显微镜（HC PL APO 93×/1.30 GLYC motCORR）观察线粒体定位MAC标记的线粒体蛋白。MAC标记的诱饵蛋白通过抗HA免疫染色（绿色）、带DAPI的细胞核（蓝色）和与pDsRed-Mito载体（红色）共转染的线粒体进行可视化，比例尺：10 微米。MS显微镜分析和由此产生的极性图将线粒体蛋白质分配到相应的线粒体隔室。分配给每个亚细胞器位置的颜色基于注释频率（绿色：0.75–1；黄色：0.5–0.75；粉红色：0–0.5）
图7
图7
通过MAC-tag数据的集成来表征相互作用距离。一–c（c）蛋白质复合物的基于距离的拓扑结构。基于诱饵归一化猎物丰度对AP-MS和BioID数据进行印迹，并使用相关数据推导CDK7和TFIIH复合体以及CDK8和MED13与介体复合体的相互作用距离。CDK7形成的CAK复合成分以灰色显示，分配给头部（洋红色）、中部（青色）和尾部（绿色）的介体复合成分以彩色编码。d日,e（电子）CDK7、CDK8和MED13的导出相互作用距离拟合到EM导出的复杂结构中，建议的拟合相互作用面以绿色虚线椭圆表示。中的颜色编码e（电子）对应于b条,c（c）.（f）可以计算诱饵蛋白质和其他复杂成分的相对距离。(克,小时)根据综合AP-MS和BioID数据得出的计算相对距离（使用PSM或MS1强度值）与介体激酶模块中两个相邻单位CDK8和MED13的极高相关性（皮尔逊和斯皮尔曼）和p值（t检验）
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