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.2018年3月22日；3（6）：e94818。
doi:10.1172/jci.insight.94818。

骨桥蛋白缺乏通过预防肾小管代谢缺陷改善Alport病理学

文丁 1 2, 凯万·尤塞菲 1 2, 剑尾草 三, 布拉德利·J·戈尔茨坦 2 三, 阿方索·L·萨巴特 4, 艾米·克鲁斯特波尔 5, 波西娅·里特 5, 杰琳·兰伯特 5, 阿曼多·门德斯 6, 丽娜A Shehadeh 2 5 7 8
附属公司

骨桥蛋白缺乏通过预防肾小管代谢缺陷改善Alport病理学

文丁等。 JCI洞察力. .

摘要

阿尔波特综合征是一种罕见的遗传性肾脏疾病，无病因治疗。我们发现骨桥蛋白（OPN）在Alport小鼠的肾小管中高度表达，并起着致病的病理作用。OPN基因缺失可改善Alport小鼠的蛋白尿、高血压、肾小管间质增殖、肾细胞凋亡以及听力和视觉缺陷。在Alport肾小管中，我们发现了广泛的胆固醇积累和动态蛋白-3（DNM3）和低密度脂蛋白受体（LDLR）的蛋白质表达增加，此外还有具有缺陷生物能量的畸形线粒体。Alport肾小管对注射的DiI-LDL胆固醇的摄取显著增加，以及Alport小鼠与胆固醇内流缺陷的Ldlr-/-小鼠杂交后寿命延长，证实了病理性胆固醇内流增加。此外，OPN缺乏的Alport小鼠表现出DNM3和LDLR表达显著降低。在人类肾上皮细胞中，过度表达DNM3导致LDLR蛋白表达升高和线粒体呼吸缺陷。我们的结果表明，在Alport病理学中，管状OPN导致DNM3和LDLR介导的胆固醇内流增加和线粒体呼吸受损，这可能是一种新的途径。

关键词：胶原蛋白；细胞因子；脂肪酸氧化；代谢；肾脏学。

PubMed免责声明

利益冲突声明

利益冲突：2017年8月，LAS和迈阿密大学申请了一项专利（PCT/US17/45536：阿尔波特综合征的治疗方法）。

数字

图1
图1。OPN在Alport小鼠中表达增加。
(A类)免疫染色和共聚焦显微镜显示，骨桥蛋白（OPN）在Alport和野生型（WT）小鼠肾小管中的表达显著升高。Tubules+表示小管和管周毛细血管中OPN染色的定量。图片代表每组6只老鼠。比例尺：20μm。Western blot和相应的密度测定显示OPN在第4a3列–/–与WT或第4a3列+/–小鼠肾脏(B类)和血浆(C类).n个=每组3-6只小鼠。量化基于3个独立实验。数据为平均值±SEM*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）< 0.001, ****P（P）<0.0001基于方差分析和Tukey的事后检验。n.d.u.，标准化密度测定单位。
图2
图2。OPN缺乏可延长患者的寿命并减轻阿尔波特病第4a3列–/–老鼠。
Kaplan-Meier生存曲线显示，阿尔波特小鼠中骨桥蛋白（OPN）缺乏导致寿命延长(A类). 对于生存曲线，n个= 25第4a3列–/–老鼠，n个=9第4a3列–/– Opn（操作）+/–、和n个= 3第4a3列–/– Opn（操作）–/–老鼠。阿尔波特小鼠OPN缺乏导致体重减轻(B类)白蛋白（ALB）和肌酐（CRE）ELISA测定的蛋白尿减少(C类)，血浆尿素氮（BUN）降低(天)和CRE(E类)血平均红细胞血红蛋白浓度（MCHC）增加(F类)，ELISA测定的血浆半乳糖凝集素-3（Gal-3）的减少(G公司)尾剪断血压系统记录的舒张压（DBP）和收缩压（SBP）降低(H（H）和我)-均与Alport小鼠相关。数据收集自8至9周龄的动物。数据为平均值±SEM*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）< 0.001, ****P（P）<0.0001基于方差分析和Tukey的事后检验。详细统计见补充表2。
图3
图3。OPN缺乏倾向于提高患者的高频听阈第4a3列–/–减轻小鼠内耳病理。
(A类)听觉脑干反应（ABR）用于记录不同频率的点击刺激（顶部面板）或纯音刺激（底部面板）的听阈。骨桥蛋白（OPN）缺乏提示Alport小鼠在16kHZ刺激下的听力改善（尽管基于Tukey事后测试的方差分析无显著性）。n个=每组6-12只小鼠。数据为平均值±SEM(B类)典型的电子显微镜（EM）图像显示Alport耳蜗基底膜增厚，这是一种由于OPN缺乏而减轻的病理学改变。插图在底部以较高的放大倍数显示。黄色箭头指向基底膜。
图4
图4。OPN缺乏减弱了第4a3列–/–老鼠。
(A类)研究了光学相干层析成像（OCT）测量原理图。ACD，前房深度；CCT，中央角膜厚度；ACAA，前囊顶角。(B类和C类)OCT测量显示，OPN缺乏时ACD和CCT没有变化，而相对于Alport小鼠，Alport骨桥蛋白缺乏（OPN缺乏）小鼠的ACAA显著增加。n个=每组3-10只小鼠。数据为平均值±SEM*P（P）< 0.05, ***P（P）< 0.001, ****P（P）<0.0001基于方差分析和Tukey的事后检验。(天)电子显微镜显示视网膜毛细血管基底膜增厚第4a3列–/–小鼠-OPN缺乏导致病理学降低。插图在底部以较高的放大倍数显示。黄色箭头指向基底膜。
图5
图5。OPN缺乏可减少Alport小鼠肾脏的肾小管细胞增殖并防止严重的肾脏病理。
(A类和B类)免疫荧光染色和相应定量显示，肾损伤分子-1（KIM-1）在Alport小鼠肾小管中的表达升高，在Alport-骨桥蛋白缺乏（OPN-deficient）小鼠中的表达降低。(C类和天)在Alport小鼠肾脏中发现大量EdU掺入，但在第4a3列–/– Opn（操作）–/–小鼠肾脏。DAPI/核染色显示为蓝色。突触体蛋白（SYNPO）染色标记肾小球。在肾小球外定量EdU染色。(E类和F类)油红染色和相应的定量显示第4a3列–/–老鼠，在第4a3列–/– Opn（操作）–/–小鼠肾脏。(G公司)典型的电子显微镜（EM）图像显示足细胞消失和肾小球基底膜（GBM）增厚第4a3列–/–与野生型（WT）或第4a3列–/– Opn（操作）–/–老鼠。插图在下部面板中以较高的放大倍数显示。足细胞被假黄色标记为GBM的边界(H（H）)EM图像用于量化足细胞进程和GBM厚度。n个对4–16张图像进行分析，以量化GBM和足细胞消失。(我)免疫染色和蛋白质印迹(J型)显示Alport肾脏中dynamin-3（DNM3）蛋白表达增加第4a3列–/– Opn（操作）–/–小鼠肾脏。对于所有染色，n个=每组3-4只小鼠，每只小鼠量化6-10张图像。比例尺：20μm。数据为平均值±SEM*P（P）< 0.05; **P（P）< 0.01, ***P（P）< 0.001, ****P（P）<0.0001，基于Tukey的事后检验的方差分析。
图6
图6。OPN缺乏可减少DNM3介导的胆固醇内流。
(A类和B类)骨桥蛋白（OPN）重组蛋白治疗导致HK-2细胞中dynamin-3（DNM3）蛋白表达增加。面板内B类,n个=每组3-4人。基于方差分析和Tukey的事后检验的统计数据。(C类和天)慢病毒在293T和HK-2细胞中过度表达DNM3，并通过qPCR验证。SCR，炒慢病毒。(E类)Western blot显示，HK-2细胞中DNM3过度表达导致LDL受体（LDLR）蛋白过度表达。(F类)在30分钟TGF-β刺激的HK-2细胞中，dynasore治疗对动力蛋白的抑制导致治疗24小时后PAI-1上调和LDLR蛋白水平下调。(G公司)在从野生型（WT）或Alport小鼠分离的30分钟TGF-β刺激的初级肾小管上皮细胞（TEC）中，通过dynasore治疗抑制动态蛋白，导致治疗24小时后LDLR蛋白水平下降。在面板中C类–G公司,n个=每组2-4人。基于学生的统计t吨测试。n.d.u.，标准化密度测定单位。(H（H）和我)低密度脂蛋白受体蛋白在Alport肾脏中表达增加，在第4a3列–/– Opn（操作）–/–肾脏。面板内我,n个=每组4-6只小鼠，每只小鼠量化4张图像。基于方差分析和Tukey的事后检验的统计数据。比例尺：20μm。(J型)Alport小鼠输注150μg DiI-LDL胆固醇后，2小时后Alport肾小管对LDL胆固醇的摄取显著增加45.9倍。面板内J型,n个=每组3只小鼠，每只小鼠量化3张图像。基于学生的统计t吨测试。比例尺：20μm。(K（K）)Kaplan-Meier曲线显示，Alport小鼠LDLR杂合缺失倾向于提高生存率。n个= 8第4a3列–/–小鼠和n个= 12第4a3列–/– Ldlr公司–/–老鼠。所有老鼠都是室友。总之，数据是平均值±SEM*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）< 0.001, ****P（P）< 0.0001.
图7
图7。海马实验显示DNM3过度表达细胞和Alport小管上皮细胞线粒体呼吸缺陷。
与野生型（WT）肾脏相比，从8周龄Alport肾分离的完整初级肾小管上皮细胞线粒体呼吸能力降低(A类和B类)或相对于加扰（SCR）对照，完整的HK-2细胞过度表达dynamin-3（DNM3）(C类和天). 对1μM寡霉素（端口A）、1μM FCCP（端口B）或2μM鱼藤酮/抗霉素A（Rot/AA）（端口D）的反应(A类和C类)脂肪酸-或(B类和天)基于葡萄糖的培养基。相应的量化显示在右侧面板中。n个=每组5–16口井。数据为平均值±SEM*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）< 0.001, ****P（P）<0.0001基于学生t吨测试。DNM3在293T细胞中的过度表达(E类)或HK-2细胞(F类)对4 mM ADP（端口A）、2μM寡霉素（端口B）、4μM FCCP（羰基氰化物4-[三氟甲氧基]苯腙）（端口C）或10μM抗霉素A（端口D）造成分离线粒体呼吸缺陷。所示为基于数据量化的能量状态。n个=每组293T细胞6–7个孔，以及n个=每组HK-2细胞2–3个孔。数据为平均值±SEM*P（P）< 0.05, **P（P）<0.01基于学生t吨测试。NS，不显著。(G公司)电子显微镜成像显示，Alport小鼠肾脏中的线粒体受压，如自噬体中的线粒体（绿色箭头）、嵴形态受损的线粒体（红色箭头）和线粒体破裂（黄色箭头）所示。比例尺：1μm。OCR，耗氧率。
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  • 骨桥蛋白在阿尔茨海默病炎症反应中的作用。
    Lalwani RC、Volmar CH、Wahlestedt C、Webster KA、Shehadeh LA。 Lalwani RC等人。 生物医学。2023年12月6日；11(12):3232. doi:10.3390/生物医学11123232。 生物医学。2023 PMID：38137453 免费PMC文章。 审查。
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