SUMOylation of the m6A-RNA methyltransferase METTL3 modulates its function

doi:10.1093/nar/gky156

.2018年6月1日；46(10):5195-5208.

doi:10.1093/nar/gky156。

m6A-RNA甲基转移酶METTL3的SUMO化调节其功能

杜玉章¹, 侯国芳^1 2, 张海龙¹, 金卓斗¹, 何剑锋¹, 郭燕明（Yanming Guo）¹, 连丽¹, 冉晨¹, 王艳丽¹, 荣登¹, 黄健¹, 滨江², 徐铭（Ming Xu）², 金科诚¹, 陈国强^三, 赵娴¹, 余建秀^1 三 4

附属公司

¹上海交通大学医学院肿瘤微环境与炎症上海重点实验室生物化学与分子细胞生物学系，上海200025。
²中国上海市漠河路280号上海交通大学医学院上海第九人民医院肿瘤科，邮编201999。
^三中国教育部细胞分化与凋亡重点实验室病理生理学系，上海交通大学医学院，上海200025。
⁴上海交通大学医学院肿瘤基因及相关基因国家重点实验室，上海200025。

PMID： 29506078
预防性维修识别码： PMC6007514型
内政部： 10.1093/nar/gky156

m6A-RNA甲基转移酶METTL3的SUMO化调节其功能

杜玉章等。核酸研究. 2018.

.2018年6月1日；46(10):5195-5208.

doi:10.1093/nar/gky156。

作者

杜玉章¹, 侯国芳^1 2, 张海龙¹, 金卓斗¹, 何剑锋¹, 郭燕明（Yanming Guo）¹, 连丽¹, 冉晨¹, 王艳丽¹, 荣登¹, 黄健¹, 蒋斌², 徐铭（Ming Xu）², 金科诚¹, 陈国强^三, 西安赵¹, 余建秀^1 三 4

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¹上海交通大学医学院肿瘤微环境与炎症上海重点实验室生物化学与分子细胞生物学系，上海200025。
²中国上海市漠河路280号上海交通大学医学院上海第九人民医院肿瘤科，邮编201999。
^三中国教育部细胞分化与凋亡重点实验室病理生理学系，上海交通大学医学院，上海200025。
⁴上海交通大学医学院肿瘤基因及相关基因国家重点实验室，上海200025。

PMID： 29506078
预防性维修识别码： PMC6007514型
内政部： 10.1093/nar/gky156

摘要

甲基转移酶样3（METTL3）是哺乳动物中大型N6-腺苷甲基转移酶复合物的关键成分，负责不同RNA中的N6-甲基腺苷（m6A）修饰，包括mRNA、tRNA、rRNA、小核RNA、微小RNA前体和长非编码RNA。然而，METTL3在激活和翻译后修饰（PTM）中的特性很少被了解。在这里，我们发现METTL3主要由SUMO1在赖氨酸残基K177、K211、K212和K215处修饰，可被SUMO1特异性蛋白酶SENP1还原。METTL3的SUMO化不会改变其稳定性、定位以及与METTL14和WTAP的相互作用，但会显著抑制其m6A甲基转移酶活性，导致mRNA中m6A水平的降低。与此一致，与人非小细胞肺癌（NSCLC）细胞系H1299-shMETTL3中野生型METTL4的表达相比，mRNA中m6A的丰度随着突变METTL3-4KR的重新表达而增加，其中内源性METTL5被敲除。mRNA中m6A的改变以及随后由METTL3的SUMO化介导的基因表达谱的改变可能直接影响H1299细胞的软黄集落形成和异种移植瘤生长。我们的结果揭示了METTL3 SUMO化调节其m6A RNA甲基转移酶活性的重要机制。

PubMed免责声明

数字

**图1。**
METTL3由SUMO1修改。(A类)METTL3在293T细胞中主要被SUMO1修饰。将转染HA-METTL3、Flag-Ubc9和His-SUMO1、-SUMO2或-SUMO3的293T细胞的裂解液与Ni沉淀²⁺-用于SUMO酸化分析的NTA树脂，然后用所示抗体进行免疫印迹。(B类)METTL3由SUMO1在多个站点修改，可由SENP1删除。将含或不含His-SUMO1、Flag-Ubc9和EBG-Senp1的HA-METTL3转染到293T细胞中，并用Ni进行SUMO酸化试验²⁺-NTA树脂。(C类)敲除Senp1增强METTL3 SUMO化。在293T细胞慢病毒系统中，Senp1被shRNA稳定地敲除。如图所示，质粒被联合转染到稳定的细胞系中。裂解物用于镍²⁺-抗HA抗体检测NTA树脂沉淀和METTL3 SUMO化。(天)内源性METTL3被SUMO1修饰。将带有或不带有Flag-Ubc9和EBG-Senp1的His-SUMO1转染至293T细胞，然后进行SUMO酸化试验，以检测带有抗METTL3抗体的SUMO化带。(E类)化疗药物诱导METTL3的SUMO化。用His-SUMO1、Flag-Ubc9和HA-METTL3转染293T细胞24 h，然后用喜树碱（20μM）、顺铂（10μM），阿霉素（2μM）或依托泊苷（10μM）处理12 h，然后收获细胞。镍²⁺-进行NTA下拉以检测METTL3的SUMO1修饰。(F类)通过IP方法证实内源性METTL3的SUMO化。用抗METTL3抗体或正常IgG裂解HeLa-pLKO.1、HeLa-shSenp1和HeLa-sh Ubc9细胞进行免疫沉淀，然后用抗SUMO1和METTL4抗体进行免疫印迹。(**G公司**)内源性METTL3的SUMO化在H1299细胞中自然发生。用H1299细胞的裂解液与抗SUMO1抗体或正常IgG进行免疫沉淀，然后用抗METTL3抗体进行免疫印迹。(**H（H）**)将稳定再表达HA-METTL3-WT或4KR的H1299-shMETTL3细胞用Etoposide（10μM）处理12 h，然后通过IP方法进行SUMO化分析。

**图2。**
K（K）¹⁷⁷，K²¹¹，K²¹²和K²¹⁵是METTL3中的主要SUMO化位点。(**A–D**)突变物4KR（K^{177/211/212/215}R）大大降低METTL3的SUMO化。HA标记的野生型（WT）或不同的METTL3突变体和His-SUMO1/Flag-Ubc9在293T细胞中表达。为镍制备裂解液²⁺-NTA下拉，然后用所示抗体进行免疫印迹。(E类)通过IP方法，在稳定的H1299细胞系中证实了METTL3在K177、K211、K212和K215的SUMO化。用HA-METTL3-WT或-4KR重新表达的H1299-shMETTL3细胞用抗HA抗体或正常IgG进行免疫沉淀，然后用抗SUMO1和HA抗体进行免疫印迹。

**图3。**
METTL3的SUMO化不影响其稳定性、定位或与METTL14和WTAP的相互作用。(A类)METTL3主要降解通过蛋白酶体途径。HA-METTL3转染293T细胞。转染后42 h，用40μM MG132或100μM氯喹处理细胞6 h，并对裂解产物进行western印迹分析。利用ImageJ（V1.45）分析METTL3的相对折叠。METTL3的（B，C）SUMO化不影响其泛素化。(B类)用RIPA缓冲液对转染有指示质粒的293T细胞进行裂解，裂解产物用抗myc抗体进行IP，然后用指示抗体进行western印迹，检测METTL3的泛素化。**（C）**将HA-METTL3-WT和HA-METTP3-4KR（含或不含Myc-Unb）转染293T细胞。将裂解液与抗Myc抗体一起用于IP，然后免疫印迹作为指示抗体。(**D、 E类**)METTL3磺酰化不会改变其核定位。将含或不含His-SUMO1、Flag-Ubc9或EBG-Senp1的HA-METTL3联合转染至293T细胞。48小时后，将细胞分为胞浆或核部分，并用所示抗体进行免疫印迹。（E） HeLa shControl、HeLa-shUbc9或HeLa-shSenp1细胞中METTL3在细胞核和细胞质部分中的分布的蛋白质印迹分析。(F类)用抗METTL3抗体或DAPI对稳定细胞HeLa-shControl、HeLa-sh-Ubc9或HeLa-sh Senp1进行免疫染色。比例尺，12.5μm。(**G、小时**)METTL3的SUMO化并不影响其与METTL14或WTAP的相互作用。将HA-METTL3-WT和HA-METTL3-4KR转染到293T细胞中，无论是否带有Flag-METTL14或Flag-WTAP。将裂解液与抗HA抗体一起用于IP，然后用指示的抗体进行免疫印迹。

**图4。**
METTL3的SUMO1修饰抑制其RNA m⁶甲基转移酶活性。纯化（A–E）聚腺苷化mRNAs用于斑点试验（上部面板），并使用细胞裂解物与指示抗体进行免疫印迹（下部面板）。(A类)METTL3是m丰度的主要成分⁶mRNA中的A。m的丰度⁶用抗m抗体的斑点试验检测shControl或shMETTL3 293T和H1299细胞的mRNA中的A⁶亚甲基蓝染色（上面板）验证了抗体和mRNAs的等载量。显示了293T和H1299细胞中METTL3的敲除效率（下图）。(B类)m的水平⁶mRNA中的A在高SUMO化状态下较低*发送1*击倒细胞。(C类)METTL3的SUMO化降低其m⁶甲基转移酶活性。将含或不含His-SUMO1/Flag-Ubc9的HA-METTL3转染至293T细胞。（D–F）SUMO-site突变4KR（K^{177/211/212/215}R） METTL3显著提高了其m⁶甲基转移酶活性。(天)将HA-METTL3-WT或-4KR瞬时导入293T细胞，并且(E类)使用慢病毒系统稳定地重新表达HA-METTL3-WT或-4KR H1299-shMETTL3。(F类)将HA-METTL3-WT或-4KR转染到293T细胞中，无论是否含有His-SUMO1/Flag-Ubc9。如前所述，进行SUMO酸化分析和斑点分析。(**G公司**)LC-MS/MS定量⁶从含有METTL3-WT或METTL3-4KR的H1299-shMETTL3细胞中纯化的聚腺苷化RNA中的A/A比率。误差线表示平均值±S.D.（两个技术副本）。(**H（H）**)*在体外*使用纯化的Flag-METTL3-WT、SUMOlated Flag-METTL3-WM或Flag-MET TL3-4KR蛋白，结合纯化的Flage-METTL14和RNA-probe（Seq1），以一致序列“GGACU”测试RNA N6-腺苷甲基化活性。RNA-probe的甲基化通过免疫印迹法测定⁶抗体。

**图5。**
METTL3的SUMO化促进H1299细胞的肿瘤发生。(A类)METTL3中4KR的突变减少了H1299细胞的软黄色集落形成。将稳定再表达的H1299-shMETTL3细胞株METTL3-WT或METTL3-4KR细胞株接种在含有10%FBS和0.35%软琼脂糖的2 ml培养基中，每孔1000粒，然后分层到0.6%凝固琼脂糖上。在播种后14天拍摄照片，并对菌落数量进行统计和分析。每个值代表三次独立实验的平均值±标准偏差。(B类)METTL3的SUMO化促进异种移植物肿瘤生长。用METTL3-WT或METTL3-4KR（2.5×10⁶细胞/每个）分别皮下注射到雄性BALB/c裸鼠体内。35天后处死小鼠，解剖肿瘤（左侧面板）并按重量评估（右侧面板）。(C类)异种肿瘤组织在NEM-RIPA缓冲液中溶解，用SUMO1抗体免疫沉淀，然后用METTL3抗体免疫印迹。用所示抗体对作为输入的1/1裂解物进行免疫印迹。

**图6。**
METTL3的SUMO化下调m⁶mRNA的一种修饰导致基因表达谱的改变。(A类)m丰度累积分布曲线⁶H1299-shMETTL3细胞转录组中METTL3-WT或METTL3-4KR重新表达的修饰。(B类)m的分布⁶整个mRNA转录组的终止密码子和3′UTR附近出现峰值。(C类)m丰度比较⁶H1299-shMETTL3细胞转录组中重新表达METTL3-WT或METTL3-4KR的A峰值。折迭变化≥2.0被认为是显著的，即m的丰度⁶METTL3-4KR相对于METTL3-WT.IP/Input的峰值被称为m的丰度⁶在MeRIP m中检测到mRNA峰值⁶A-Seq（IP）根据RNA-Seq中检测到的值进行归一化（输入）。(天)热图显示重新表达METTL3-WT或METTL3-4KR的H1299-shMETTL3细胞中mRNA表达谱的变化。

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