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.2018年4月；24(4):499-512.
doi:10.1261/rna.064063.117。 Epub 2018年1月18日。

m的相互作用、定位和磷酸化6生成METTL3-METTL14-WTAP复合体

伊娃·舍勒 # 1, 弗兰齐斯卡·魏希曼 # 1, 托马斯·特雷伯 # 1, 萨姆·林格尔 1, 诺拉·特雷贝尔 1, 安德鲁·弗拉特利 2, 里贾纳馈线 2, 阿斯特丽德·布鲁克曼 1, 冈特·梅斯特 1
附属公司

m的相互作用、定位和磷酸化6生成METTL3-METTL14-WTAP复合体

伊娃·舍勒等。 核糖核酸. 2018年4月.

摘要

N个6-甲基腺嘌呤（m6A） 在包括mRNA在内的许多真核RNA上发现。米6修饰与mRNA的稳定性和周转、定位或翻译效率有关。由METTL3和METTL14组成的异二聚酶复合物产生m6关于信使核糖核酸。METTL3/14位于细胞核中，定位于核斑点，剪接调节器WTAP是这种独特的核定位模式所必需的。尽管最近的晶体结构揭示了METTL3和METTL14的催化MT-A70结构域如何相互作用，但迄今为止还没有报道包括WTAP和RNA相互作用在内的更具全球性的结构。在这里，我们使用了重组蛋白并绘制了METTL3/14-WTAP复合物中的结合表面。此外，我们还鉴定了核定位信号和内源性蛋白质上的磷酸化位点。通过体外甲基化试验，我们确认单体METTL3是可溶的且不活泼的，而METTL14的催化中心退化，因此也不活泼。此外，我们还表明，METTL14的C末端RGG重复序列通过促进RNA底物结合，对METTL3/14活性是必需的。我们的生物化学工作确定了METTL3/14-WTAP的特征，并揭示了对这一重要酶复合物整体结构的新见解。

关键词：METTL14；METTL3；RNA修饰；m6A；甲基转移酶。

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数字

图1。
图1。
METTL3、METTL14和WTAP的结合研究。(A类)纯化重组全长GST-METTL3和铜纯化METTL14的考马斯凝胶。在昆虫细胞（SF21）中进行了共表达。该复合物通过METTL3上的GST标签进行纯化。(B类)F/H-METTL3和myc-METTL14不同截断结构的示意图，用于缩小这些蛋白质的结合位点。(C类)由所示截短的METTL14和METTL3（76-580）结构体组成的重组表达和纯化复合物的考马斯凝胶。通过GST-METTL3（76-580）纯化复合物，随后在洗脱过程中分离GST。(D类)共表达研究揭示了METTL3和METTL14之间相互作用表面的示意图。(E类)不同WTAP N端和C端截断构造的方案。(F类)全长F/H-METTL3与myc-WTAP N末端截短的共免疫沉淀的Western blot。这个上面的面板与α-HA抗体孵育降低一个带有α-myc抗体。箭头显示了不同构件的标注栏。(G公司)共免疫沉淀的免疫印迹F类但使用myc-WTAP的C末端截断构造。(H（H）)共免疫沉淀全长myc-WTAP和F/H-METTL3（ΔLH-METTL3）LH-deletion突变体的Western blot。(我)F/H-METTL3（先导螺旋，短LH）N末端部分与myc-WTAP的C末端截短结构共免疫沉淀的Western blot。这个上面的面板显示了HA抗体处理过的斑点降低免疫印迹显示α-myc-western印迹。(J型)基于共免疫沉淀实验结果的WTAP和METTL3相互作用区域示意图。
图2。
图2。
METTL3、METTL14和WTAP的本地化研究。(A类)野生型myc-WTAP转染HeLa细胞的免疫荧光染色(上面的面板）和myc-WTAP-NLS突变体（mut）(降低面板）。示意图卡通在下面免疫荧光显示了NLS在蛋白质中的非常N-末端的位置和序列。(B类)转染WT的HeLa细胞的免疫荧光(上面的面板）和NLS突变F/H-METTL3(降低面板）。如示意图所示，在先导螺旋线和MT-A70域之间的潜在RBD中预测计算的NLS在下方染色。(C类)F/H-METTL3-NLS突变体和myc-WTAP之间共免疫沉淀的Western blot。含有myc-或F/H标签的GFP用作控制。(D类)用myc-METTL14 WT转染HeLa细胞(上面的面板）和预测的F/H-NLS突变(降低面板）。这幅漫画显示了蛋白质中潜在NLS的位置和序列。(E类)对于上面的将myc-METTL14和F/H-METTL3转染HEK293T细胞。这个降低面板显示myc-METTL14和预测的F/H-METTL3-NLS突变的免疫荧光染色。(F类)不同F/H-METTL3和myc-METTL14构建物联合免疫沉淀的Western blot。对照组为GFP。
图3。
图3。
METTL3单克隆抗体的建立。(A类)上面的western blot显示F/H-METTL3的IP，一方面使用α-FLAG抗体沉淀，另一方面使用已建立的α-METTL3抗体29C8。用α-HA抗体孵育印迹。这个降低面板显示了使用METTL3抗体的内源性METTL3-IP的western blot。(B类)使用抗METTL3抗体29C8纯化的内源性METTL 3考马斯凝胶。METTL14共免疫沉淀。控制IP不显示任何频带。
图4。
图4。
METTL3/14复合物中磷酸化位点的鉴定和表征。(A类)METTL3和METTL14的免疫共沉淀。为了分析磷酸化位点，用α-METTL3 29C8抗体从核HeLa S3裂解液中纯化内源性METTL3。共免疫沉淀内源性METTL14。(B类)人体METTL3/14复合物的质谱测量。METTL3和METTL14蛋白磷酸化位点示意图。结构域（先导螺旋[LH]；核定位序列[NLS]；N末端α-螺旋基序[NHM]；C末端基序[CTM]）以灰色显示，磷酸化位点以红色条表示。(C类)在METTL3和METTL14中检测到的磷酸化位点的保守性。在我们的分析中测量到的METTL3和METTL14的磷酸化位点显示为红色(D类)METTL3 S219磷酸化变体的核定位。通过α-FLAG抗体染色（绿色）检测F/H-METTL3构建物。用α-Myc抗体（红色）观察Myc-METTL14。细胞核用DAPI（蓝色）染色。(E类)LH周围磷酸化位点对WTAP相互作用的影响。用F/H-METTL3磷酸化突变体和myc-WTAP转染HEK293T细胞。通过α-FLAG-IP纯化复合物。随后通过western blotting观察F/H-METTL3构建物和铜纯化myc-WTAP。
图5。
图5。
METTL3和METTL14的磷酸化位点对甲基化活性不是必需的。(A类)METTL3中心区域的磷酸化位点不影响与myc-METTL14的相互作用。将F/H-METTL3磷酸化突变体与myc-METTL14一起转染HEK293T细胞。通过α-FLAG-IP纯化复合物。western blotting显示F/H-METTL3结构和铜纯化myc-METTL14。(B类)METTL3/14野生型和突变变异体甲基转移酶活性的测量。两种蛋白质催化中心的点突变如示意图所示。数据显示为六个独立重复的平均值±SD。作为对照，在10%SDS凝胶上分离1µg重组蛋白，并用考马斯蓝染色。(C类)WT METTL3/14复合物的甲基转移酶活性以及磷酸化残基T348和S350中的变体。数据显示为五个独立重复的平均值±SD。作为对照，在10%SDS凝胶上分离1µg重组蛋白，并用考马斯蓝染色。(D类)METTL14（绿色）中磷酸化残基S399与METTL3（蓝色）中R471的结构环境。(左侧)pS399位于METTL3/14相互作用表面内。(赖特)pS399与R471残留物的潜在接触。(E类)F/H-METTL3与myc-METTL14的S399A和S399E突变体的共免疫沉淀。用F/H-METTL3和myc-METTL14构建物转染HEK293T细胞。通过α-FLAG-IP纯化F/H-METTL3。所有myc-METTL14构建物均经铜纯化并通过western blotting显示。(F类)WT METTL3/14的体外甲基转移酶活性和METTL14磷酸化S399残基中的突变体。如示意图所示，对METTL14的磷酸化残基S399进行了修饰。数据显示为六个独立重复的平均值±SD。作为对照，在10%SDS凝胶上分离1µg重组蛋白，并用考马斯蓝染色。值得注意的是，针对HA和myc标签的初级抗体同时添加到同一个蛋白印迹膜上。由于F/H-METTL3和myc-METTL14在凝胶上的迁移相同，因此蛋白质印迹看起来非常相似(A类,E类).
图6。
图6。
RGG缺失影响METTL3/14的催化活性和底物结合(A类)缺乏RGG重复序列的METTL3和METTL14甲基转移酶活性分析。如示意图所示，直接或通过TEV蛋白酶裂解（METTL14 TEV-RGG）介导截短METTL15序列（METTL24ΔRGG）。数据显示为五个独立重复的平均值±SD。作为对照，在SDS凝胶上分离1µg重组蛋白，并用考马斯蓝染色。(B类)全长METTL3/14和METTL3/14ΔRGG的RNA结合。在50µL反应混合物中连续稀释蛋白质。(C类)使用交联和免疫沉淀（CLIP）对F/H-METTL14进行RNA结合研究。将带有F/H-METTL14-WT或F/H-METTL14-ΔRGG的F/H-GETTL3转染到生长在含有4SU的培养基和UV交联（356 nm）中的HEK293T细胞中。在α-FLAG-IP和RNase T1消化后，结合的RNA被放射性标记，蛋白-RNA复合物被SDS-PAGE分离并印在硝化纤维素膜上。通过放射自显影术观察交叉连接RNA。
图7。
图7。
METTL3（蓝色）、METTL14（绿色）和WTAP（红色）相互作用表面的示意图。建议的工作模型包括METTL3/14的磷酸化位点（红色）以及METTL3（蓝色）和WTAP（棕色）的NLS基序。METTL3催化RRACH基序内腺苷碱（红色）的甲基化。METTL14协调并稳定RNA结合。
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