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.2017年12月4日;8(1):1921.
doi:10.1038/s41467-017-02114-x。

ATM和CDK2控制染色质重塑剂CSB在DSB修复途径选择中抑制RIF1

附属公司

ATM和CDK2控制染色质重塑剂CSB在DSB修复途径选择中抑制RIF1

尼科尔·巴滕伯格等。 国家公社. .

摘要

CSB是SWI2/SNF2超家族的成员,与DNA双链断裂(DSB)修复有关。然而,它是如何调节这种修复过程的还不太清楚。在这里,我们发现CSB通过其新发现的翼螺旋结构域与RIF1(53BP1的效应器)相互作用,并且这种相互作用在S期介导CSB向DSB的招募。在DSB,CSB通过清除组蛋白重塑染色质,这限制了RIF1及其效应物MAD2L2,但促进了BRCA1的积累。CSB的染色质重塑活性不仅需要ATM对S10的损伤诱导磷酸化,还需要细胞周期蛋白A-CDK2对S158的细胞周期依赖性磷酸化。这两种修饰都调节CSB N末端区域与其ATP酶结构域的相互作用,此前曾报道其活性被N末端区域自动抑制。这些结果表明,ATM和CDK2在调控DSB修复途径选择中控制CSB的染色质重塑活性。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有竞争性的经济利益。

数字

图1
图1
CSB与RIF1相互作用,并被RIF1招募到FokI诱导的DSB。诱导或不诱导FokI表达的U2OS-265细胞的免疫荧光。固定细胞用抗CSB抗体染色。在本图和下图中,细胞核用蓝色DAPI染色。比例尺,5微米。b条表达Myc-tagged CSB的U2OS-265细胞的免疫荧光,诱导或不诱导FokI表达。固定细胞用抗Myc抗体染色。比例尺,5微米。c(c)量化FokI诱导的DSB中累积有Myc-CSB的U2OS-265细胞百分比。用DMSO或ATM抑制剂KU55933处理U2OS-265细胞1h,在诱导FokI表达之前。每个独立实验共对250个Myc表达细胞进行了盲法评分。指出了三个独立实验的标准偏差,在本图和后续图中称为SD*P(P) < 0.05(学生测试)。FokI-诱导的DSB中含有Myc-CSB的亲本和53BP1 KO U2OS-265细胞百分比的定量。按照1c所述进行评分。显示了三个独立实验的SD*P(P) < 0.05(学生测试)。e(电子)抗Myc抗体的免疫荧光。48FokI诱导前h,用抗干扰DNA(siControl)或RIF1(siRIF1)的siRNA转染U2OS-265细胞。比例尺,5微米。(f)定量FokI诱导的DSB中累积有Myc-CSB的siControl和siRIF1表达U2OS-265细胞的百分比。按照1c所述进行评分。显示了三个独立实验的SD*P(P) < 0.05(学生测试)。在FokI诱导的DSBs中积累的具有Myc-CSB的表达siControl-和siCSA的U2OS-265细胞的百分比的定量。按照1c所述进行评分。显示了三个独立实验的SD。小时用IgG和抗CSB抗体协同免疫沉淀HCT116细胞用抗CSB、抗RIF1和抗53BP1抗体进行免疫印迹。本图和后续图中显示了以kDa表示的蛋白质分子量标记。经或不经20Gy IR。用抗RIF1、抗53BP1和抗CSB抗体进行免疫印迹
图2
图2
RIF1与CSB互动,并通过其CTD域将CSB招募到DSB。RIF1示意图。NLS:核定位信号;CTD:C末端结构域。b条CSB示意图。c(c)量化在lac操作员阵列中显示Myc-CSB的细胞百分比。如图所示,用Myc-CSB和各种mCherry-LacR-RIF1等位基因共同转染U2OS-265细胞。在每个独立实验中,共对250个Myc-CSB表达阳性的细胞进行盲法评分。显示了三个独立实验的SD。量化在lac操作员阵列中显示Myc染色的细胞百分比。如图所示,用mCherry-LacR-RIF1-C和各种Myc-tagged CSB等位基因共同转染U2OS-265细胞。在每个独立实验中,共有250个细胞对指示的各种Myc-tagged CSB等位基因表达阳性进行了盲法评分。显示了三个独立实验的SD。e(电子)在lac算子阵列处积累的表现出Myc-CSB-C的细胞的百分比的定量。如图所示,用Myc-CSB-C和各种mCherry-LacR-RIF1-C等位基因共同转染U2OS-265细胞。在每个独立实验中,共对250个Myc-CSB-C表达阳性的细胞进行盲法评分。显示了三个独立实验的SD。(f)如图所示,在293T细胞中与抗Myc抗体共免疫沉淀单独表达载体或与各种mCherry-LacR-CTD等位基因结合的Myc-CSB-C。用抗Myc和抗mCherry抗体进行免疫印迹。FokI诱导DSB位点Myc-CSB信号强度的量化。24在用siControl或siRIF1转染后h,U2OS-265细胞用单独的EGFP载体或各种siRIF1抗性EGFP-RIF1等位基因转染,如所示并诱导FokI表达48转染后h。仅对Myc-CSB、EGFP和mCherry-LacR-FokI表达阳性的细胞进行Myc-CSP信号强度分析。siControl/EGFP、siRIF1/EGFP,siRIF1/GGFP-RIF1和siRIF1/EGFP-Rif-DCTDIII分析的细胞数分别为131、107、120和124*P(P) < 0.05(Mann-Whitney试验)。NLS核定位信号;UBD泛素结合域;WHD翼螺旋结构域
图3
图3
CSB与RIF1相互作用并在DSB抑制RIF1。量化与指示等位基因共转染的U2OS-265细胞中,在lac操作员阵列中显示Myc染色的细胞百分比。在每个独立实验中,共对250个Myc染色阳性的细胞进行盲法评分。显示了三个独立实验的SD。b条FokI诱导的DSB部位出现Myc染色的细胞百分比的量化。在每个独立实验中,共有250个U2OS-265细胞表达指示的各种Myc-tagged CSB等位基因,对其进行盲法评分。显示了三个独立实验的SD。c(c)FokI诱导的DSB处RIF1信号强度的量化。亲代和CSB KO分析的细胞数量分别为275和277*P(P) < 0.05(Mann-Whitney试验)。FokI诱导的DSB中显示MAD2L2的细胞百分比的量化。每个独立实验共有500–550个细胞以盲法进行评分。显示了三个独立实验的SD*P(P) < 0.05(学生测试)。e(电子)定量FokI诱导的DSB中显示GFP-PTIP的细胞百分比。每个独立实验共对500个细胞进行盲法评分。显示了三个独立实验的SD。(f)FokI诱导的DSB BRCA1信号强度的量化。亲代和CSB KO分析的细胞数分别为282和294*P(P) < 0.05(Mann-Whitney试验)。HR介导的修复I级-在U2OS-DR-GFP WT和CSB-KO细胞中诱导DSB。显示了三个独立实验的SD*P(P) < 0.05(学生测试)。小时NHEJ介导的维修I级-诱发的DSB。显示了三个独立实验的SD*P(P) < 0.05(学生测试)。FokI诱导的DSB处RIF1信号强度的量化。单独分析载体Myc-CSB、Myc-CSB-GG和Myc-CSS-GG的细胞数量分别为298、304、204和209*P(P) < 0.05(Mann-Whitney试验)。j个FokI诱导的DSB BRCA1信号强度的量化。单独分析载体Myc-CSB、Myc-CSB-GG和Myc-CSS-GG的细胞数分别为279、270、291、258*P(P) < 0.05(曼-惠特尼检验)
图4
图4
CSB被招募到FokI诱导的S期DSB中以抑制RIF1。量化同步表达Myc-CSB的U2OS-265细胞在FokI诱导的DSB中显示指示蛋白的百分比。对于Myc-CSB,每个独立的盲实验共对250个Myc-CSB-表达细胞进行评分。对于RIF1,在每个独立实验中,共有500–550个细胞被盲法评分。显示了三个独立实验的SD。b条定量FokI诱导的DSB中同步表达Myc-CSB的U2OS-265细胞显示γH2AX的百分比。在每个独立实验中,总共对500–550个细胞进行盲法评分。显示了三个独立实验的SD。c(c)U2OS-265亲代(WT)和53BP1 KO细胞的Western分析。γ-微管蛋白印迹被用作此处和下图的负荷控制。在FokI诱导的DSB中用γH2AX定量U2OS-265 WT和53BP1 KO细胞的百分比。得分与3b一样。显示了三个独立实验的SD。e(电子)FokI诱导的DSB中使用RIF1定量U2OS-265 WT和53BP1 KO细胞的百分比。如图3b所示进行评分。显示了三个独立实验的SD。(f)在FokI诱导的DSB中,与Myc-CSB同步表达Myc-CSB-WT和53BP1 KO U2OS-265细胞百分比的量化。在每个独立的盲实验中,共对250个Myc-CSB表达细胞进行评分。显示了三个独立实验的SD*P(P) < 0.05(学生测试)。在FokI诱导的DSBs下,用γH2AX定量U2OS-265 WT和CSB-KO细胞的百分比。按照图3b进行评分。显示了三个独立实验的SD。小时FokI诱导的DSB中与RIF1同步的U2OS-265 WT和CSB KO细胞百分比的量化。按照图3b进行评分。显示了三个独立实验的SD*P(P) < 0.05(学生测试)。在FokI诱导的DSBs处用BRCA1同步的U2OS-265 WT和CSB KO细胞的百分比的定量。按照图3b进行评分。显示了三个独立实验的SD*P(P) < 0.05(学生测试)。j个U2OS-265 WT和CSB KO细胞的Western分析
图5
图5
CSB在体内将组蛋白从I-PpoI诱导的DSBs周围的染色质中排出。组蛋白H2A在表达ddI-PpoI的hTERT-RPE亲代细胞中的相对占有率。细胞要么未经处理(untx),要么用Shield-1和4-OHT处理,然后在指定的时间收集。这个x个-轴表示1号染色体上I-PpoI诱导的DSB上游和下游的距离,单位为kb,设置为0。这个-轴表示处理细胞相对于未处理细胞的H2A相对占有率。指出了三个独立实验的平均值标准误差(SEM)。b条组蛋白H2B在表达ddI-PpoI的hTERT-RPE亲代细胞中的相对占有率。两者都有x个-和-轴如所述显示了三个独立实验的SEM。c(c)组蛋白H2A在表达ddI-PpoI的hTERT-RPE CSB KO细胞中的相对占有率。两者都有x个-和-轴如所述显示了三个独立实验的SEM。组蛋白H2B在表达ddI-PpoI的hTERT-RPE CSB KO细胞中的相对占有率。两者都有x个-和-轴如所述显示了三个独立实验的SEM。e(电子)组蛋白H2A在表达ddI-PpoI的hTERT-RPE CSB KO细胞中的相对占有率,与单独载体、Myc-tagged野生型CSB或Myc-tag突变体CSB-W851R互补。两者都有x个-和-轴如5a所述。显示了三个独立实验的SEM。(f)组蛋白H2B在表达ddI-PpoI的hTERT-RPE CSB KO细胞中的相对占有率,与单独载体、Myc标记野生型CSB或Myc标记突变CSB-W851R互补。两者都有x个-和-轴如所述.显示了三个独立实验的SEM
图6
图6
CSB的N末端介导其染色质重塑活性,以抑制DSBs位点的RIF1积累。如图所示,组蛋白H2A在表达ddI-PpoI的CSB KO hTERT-RPE细胞中的相对占有率与各种等位基因互补。两者都有x个-和-轴如图5a所示。显示了三个独立实验的SEM。b条如图所示,组蛋白H2B在表达ddI-PpoI的CSB KO hTERT-RPE细胞中的相对占有率与各种等位基因互补。两者都有x个-和-轴如图5a所示。显示了三个独立实验的SEM。c(c)表达各种等位基因的hTERT RPE IPpoI CSB KO细胞的Western分析表明。量化在FokI诱导的DSB中显示抗Myc染色的表达Myc-CSB和Myc-CSB-ΔN30的U2OS-265细胞的百分比。在每个独立实验中,总共对250个抗Myc染色阳性的细胞进行盲法评分。显示了三个独立实验的SD。e(电子)细胞周期蛋白A-和细胞周期蛋白A百分比的量化 + 具有10个或更多IR诱导的RIF1病灶的细胞。用2Gy IR和固定1IR后h。以盲法对每个独立实验总共500–550个细胞进行评分。显示了三个独立实验的SD*P(P) < 0.05. 纳秒:P(P) > 0.05(学生测试)。(f)细胞周期蛋白A百分比的量化 + 包含的单元格 ≥ 10个IR诱导的BRCA1病灶。评分按照e(电子).显示了三个独立实验的SDs*P(P) < 0.05. 纳秒:P(P) > 0.05(学生测试)。细胞周期蛋白A百分比的量化 + 具有10个或更多IR诱导的RAD51病灶的细胞。用2Gy IR和固定4IR后h。按照e(电子).显示了三个独立实验的SDs*P(P) < 0.05. 纳秒:P(P) > 0.05(学生测试)。小时克隆存活分析。显示了三个独立实验的SD*P(P) < 0.05(学生测试)用于CSB和ΔN30之间的比较。HR介导的修复。显示了三个独立实验的SD*P(P) < 0.05. 纳秒:P(P) > 0.05(学生测试)。j个U2OS-DR-GFP亲本和CSB KO细胞的Western分析
图7
图7
ATM通过S10磷酸化控制CSB的染色质重塑活性。对稳定表达各种等位基因的U2OS CSB KO细胞进行Western分析。用或不用10Gy红外。b条HCT116细胞中抗CSB免疫沉淀物的Western分析Gy红外。c(c)西方分析。用DMSO、ATM抑制剂KU55933、ATR抑制剂VE-821或DNA PKcs抑制剂NU-7026处理Myc CSB表达U2OS CSB KO细胞110之前的hGy红外。ATM缺陷的GM16666A和ATM补充的GM16667A细胞的Western分析。用载体或Myc-CSB转染细胞,然后用10Gy红外48转染后h。e(电子)如图所示,组蛋白H2A在ddI-PpoI-表达的hTERT-RPE CSB KO细胞中的相对占有率与各种等位基因互补。两者都有x个-和-轴如图5a所示。显示了来自三个独立实验的SEM。(f)如图所示,组蛋白H2B在ddI-PpoI-表达的hTERT-RPE CSB KO细胞中的相对占有率与各种等位基因互补。两者都有x个-和-轴如图5a所示。显示了三个独立实验的SEM。量化具有10个或更多IR诱导的RIF1病灶的细胞周期蛋白A-和细胞周期蛋白A+细胞的百分比。用2Gy IR和固定1IR后h。每个独立实验共对500–550个细胞进行盲法评分。显示了三个独立实验的SD*P(P) < 0.05. 纳秒:P(P) > 0.05(学生测试)。小时细胞周期蛋白A+细胞百分比的量化 ≥ 10个IR诱导的BRCA1病灶。按照第7条进行评分g.显示了来自三个独立实验的SD*P(P) < 0.05. 纳秒:P(P) > 0.05(学生测试)。量化具有10个或更多IR诱导的RAD51病灶的细胞周期蛋白A+细胞百分比。用2Gy IR和固定4IR后h。按照第7条进行评分g.显示了来自三个独立实验的SD*P(P) < 0.05. 纳秒:P(P) > 0.05(学生测试)
图8
图8
细胞周期蛋白A–CDK2通过S158磷酸化控制CSB的染色质重塑活性。对仅稳定表达载体Myc-CSB或携带S158A突变的Myc-CSB-KO细胞的U2OS-CSB-KO细胞进行Western分析。用抗CSB-SS158和抗Myc抗体进行免疫印迹。b条同步化HCT116细胞的Western分析。箭头指示CSB-BS158的位置。星号表示非特定带。c(c)西方分析。如图所示,使用二甲基亚砜或CDK抑制剂roscovitine处理双胸苷块释放后的异步和同步HCT116细胞。箭头指示CSB-BS158的位置。星号表示非特定带。用重组细胞周期蛋白A-CDK2和细菌表达的重组CSB片段进行体外激酶分析,如图所示。e(电子)如图所示,组蛋白H2A在ddI-PpoI-表达的hTERT-RPE CSB KO细胞中的相对占有率与各种等位基因互补。两者都有x个-和-轴如图5a所示。显示了三个独立实验的SEM。(f)组蛋白H2B在表达ddI-PpoI的hTERT RPE CSB KO细胞中的相对占有率,如图所示,与各种等位基因互补。两者都有x个-和-轴如图5a所示。显示了三个独立实验的SEM。量化具有10个或更多IR诱导RIF1病灶的细胞周期蛋白A−和细胞周期蛋白A+细胞的百分比。用2Gy IR和固定1IR后h。每个独立实验共对500–550个细胞进行盲法评分。显示了三个独立实验的SD*P(P) < 0.05. 纳秒:P(P) > 0.05(学生测试)。小时细胞周期蛋白A+细胞百分比的量化 ≥ 10个IR诱导的BRCA1病灶。按照第8条进行评分g.显示了来自三个独立实验的SD*P(P) < 0.05. 纳秒:P(P) > 0.05(学生测试)。如图所示,经olaparib处理的hTERT-RPE CSB-KO细胞与各种等位基因互补后的克隆存活分析。显示了三个独立实验的SD*P(P) < 0.05(学生试验)用于CSB和S158A之间的比较
图9
图9
S10和S158上的CSB磷酸化调节N末端与ATP酶结构域的相互作用。Myc-CSB-N与mCherry-LacR-CSB-ATP酶或mCherry-LacR-CSB-C联合转染的U2OS-265细胞的免疫荧光。比例尺,5微米。b条U2OS-265细胞百分比的量化在FokI诱导的DSBs处进行抗Myc染色。每个独立实验共对250个Myc表达细胞进行了盲法评分。显示了三个独立实验的SD。c(c)在FokI诱导的DSB中用抗Myc染色定量U2OS-265细胞的百分比。如图所示,U2OS-265与各种等位基因共转染。每个独立实验共对250个Myc表达细胞进行了盲法评分。显示了三个独立实验的SD*P(P) < 0.05(学生测试)。S/G2中DNA DSB修复路径选择中ATM和CDK2控制CSB染色质重塑活性的模型。详见正文

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