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.2017年10月18:6:e27356。
doi:10.7554/eLife.27356。

蛋白磷酸酶网络控制人类表皮分化承诺的时空动态

附属公司

蛋白磷酸酶网络控制人类表皮分化承诺的时空动态

阿杰·米什拉等。 埃利夫. .

摘要

表皮内稳态取决于干细胞更新和终末分化之间的平衡。这两种细胞状态之间的转换,即承诺,目前尚不清楚。在这里,我们通过整合来自分离的原始人类角朊细胞的转录组学和蛋白质组学数据来表征承诺,这些细胞悬浮在悬浮液中以诱导分化。细胞分离诱导多种蛋白磷酸酶,其中5种-DUSP6、PPTC7、PTPN1、PTPN13和PPP3CA-通过负调控ERK MAPK和正调控AP1转录因子促进分化。相反,DUSP10表达与承诺相反。磷酸酶形成了一个随时间变化的短暂正负相互作用的动态网络,DUSP6在承诺时占主导地位。布尔网络建模通过不稳定(承诺)状态确定两个稳定状态(干状态和差分状态)之间的强制切换。在体内和体外,磷酸酶的表达也受到空间调控。我们的结论是,自我调节磷酸酶网络通过控制承诺的开始和持续时间来维持表皮内稳态。

关键词:布尔网络;承诺;计算生物学;发育生物学;区别;表皮;人;蛋白质脱磷酸化;干细胞;系统生物学。

PubMed免责声明

利益冲突声明

副主编:,电子生活.

没有宣布竞争利益。

数字

图1。
图1.基因组和蛋白质组分析确定与承诺相关的蛋白质去磷酸化事件。
()实验设计示意图。(b)不同时间从悬浮液中采集的细胞形成集落。代表性培养皿与菌落形成百分比一起显示(n=2个独立实验,n=3个培养皿/条件/实验;p值通过Tukey多重比较测试计算)。(c(c))在不同时间点从悬浮液中分离的细胞被标记为抗总苞醇(IVL)抗体(绿色)和DAPI作为核染色(蓝色)。使用ImageJ对IVL阳性细胞进行计数(n个=3种独立文化;每个条件计数超过300个细胞。通过双尾计算的p值t吨-测试)。比例尺:50μm(d日)RT-qPCR定量ITGα6、TP63、IVL和TGM1 mRNA水平(相对于18s表达)(n个=3种独立文化)。(e(电子))角朊细胞悬浮不同时间后全基因组转录表达的t-SNE图。t-SNE算法在高维空间中获取一组点,并在低维空间(通常是2D平面)中找到这些点的忠实表示。((f))热图表示差异表达蛋白的层次聚类(p<0.05)。(g–i类)点图将在至少一个时间点相对于0小时变化两倍的显著差异表达肽(p<0.05)的表达与其相应的差异表达转录物关联起来。皮尔逊相关性(第页)显示。(j个)标准化SILAC比率直方图,对应于0到4小时之间差异的高置信度磷酸化位点(k个)散点图相关日志2总蛋白变化(y轴)的归一化SILAC比率(对数)2磷酸肽比率(x轴)在0到4小时之间(b、 c(c))*p<0.05**p<0.01;ns=不显著)。
图1-图补充1。
图1补充图1:悬浮诱导终末分化的克隆生长、基因组和蛋白质组分析。
()在甲基纤维素悬浮液中0、1、2、4、6、8、10、12或24小时后收集的角质形成细胞接种在10厘米内的100、500或1000个细胞上2培养皿置于有丝分裂失活的J23T3饲养器上,培养12天。染色后,使用ImageJ对菌落进行计数(n个=2个独立实验,每个实验有三个重复的培养皿;双尾计算的p值t吨-测试)。(b)RT-qPCR定量测定悬浮液中不同时间IVL和TGM1 mRNA水平(n个=3种独立文化;双尾计算的p值t吨-测试)。(c(c))悬浮液中不同时间DLL1、Ki67和Lrig1 mRNA水平的RT-qPCR定量(n个=3种独立文化;通过单因素方差分析计算的p值)。(d日)悬浮状态下0、4、8和12小时显著表达的转录物的层次聚类(每个时间点代表n=3个独立实验的平均值)。(e(电子))差异表达基因在4、8和12小时相对于0小时上调的GO分析。条形图表示–log10确定GO项的p值。((f))SILAC-质谱标记协议示意图。()在4、8和12小时,蛋白质的GO分析按其表达水平的顺序排列(相对于0小时的倍数增加)。GO术语是针对单个蛋白质而非蛋白质簇的。条形图表示–对数10确定GO项的p值。(a–c)误差线代表标准差*p<0.05**p<0.01***p<0.005;ns=不显著。
图2。
图2.功能屏幕识别调节承诺的候选磷酸酶。
()热图显示4小时、8小时和12小时相对于0小时磷脂酶的差异表达,磷脂酶在微阵列数据集中4小时上调。(b)敲除22种磷酸酶的效果()角质形成细胞的克隆生长。绘制的值是n=3个独立筛选中的平均克隆增长率%,每个筛选中n=3种独立培养物。绿色:siSCR控制。红色、蓝色:显示对菌落形成具有统计显著影响的磷酸酶(红色:增加;蓝色:减少)。灰色:无统计学显著影响。(c、 d日)敲除对悬浮培养0、4、8或12小时后克隆生长的影响。(c(c))代表性菜肴。(d日)克隆生长平均%的定量±SD(n个=3个独立样本)。未配对T检验产生的p值。(e、 (f))TP63的RT-qPCR定量(e(电子))和TGM1((f))mRNA水平(相对于18s表达)与(c(c)).n个=3个独立转染。()敲除DUSP6、PTPN1、PPP3CA或PTPN13后的表皮重建分析。n个=2个独立转染。顶行显示具有代表性的H和E图像。在多个字段中对每个重复的八个截面的表皮厚度进行了定量,±SD为对照组(siSCR)。中间一行显示TP63(粉红色)染色,DAPI核复染(蓝色)。%DAPI标记的TP63+细胞核在n个=每次复制2-3个字段。底行显示Ki67(棕色)用苏木精复染(蓝色)染色。%Ki67+细胞核在n个=每个复制3–6个字段。误差线代表平均值±标准差。使用单因素方差分析和Dunnett多重比较测试计算p值(*p<0.05;**p<0.01;***p<0.0005;***p<0.0001;ns=不显著)。
图2——图补充1。
图2-图补充1。通过悬浮诱导分化鉴定的蛋白磷酸酶在公开数据集中的表达。
()热图显示钙诱导原代人角质形成细胞分层期间候选磷酸酶的mRNA表达(GSE38628)。(b)热图显示了体外人表皮重建过程中候选磷酸酶的mRNA表达(GSE52651)。
图2——图补充2。
图2补充图2。磷酸酶敲除对角质形成细胞生长和分化的影响。
()磷酸酶敲除对菌落形成的影响。绘制的值是三个独立筛网中的平均菌落形成百分比,每个筛网有三个重复培养皿。p值是使用双尾t吨-测试。(b)siRNA转染后,将角质形成细胞接种在胶原蛋白涂层的96-well培养皿中,并在KSFM培养基中培养三天。转染后24小时,将培养皿移入培养皿显微镜,在接下来的48小时内每小时扫描一次,以评估细胞生长和增殖。每个数据点是三个重复屏幕的平均值,每个屏幕每个条件有八个独立的井扫描。将每个时间点的值标准化为相应的0小时时间点或第一个扫描点。累积图显示了细胞倍增的相对频率(%)。(c(c))RT-qPCR定量相对18s RNA的磷酸酶mRNA水平,作为悬浮时间的函数,显示起始种群中不同敲除的效率。通过不成对的T检验产生p值。(d日)从悬浮液中回收的细胞形成的菌落所占总面积的变化动力学。(n个=3个独立样本)。第页-未配对T检验产生的值。(e(电子))通过拟合数据计算磷酸酶敲除后人类角质形成细胞的生长率(b)指数增长曲线,并对速率进行平均。单向方差分析生成的p值((f))图2g所示实验的重组表皮切片,用ITGβ1和IVL抗体标记,DAPI作为核复染物。描述了合并和单个通道图像。比例尺:50μm。()图2g所示实验的量化,显示了每μm基底膜中TP63+(顶面板)或Ki67+细胞(底面板)的数量。DAPI标记的TP63+细胞核在n个=每个复制2–3个字段。%Ki67+细胞核在n个=每个复制3–6个字段。误差条表示平均值±标准差。使用单因素方差分析计算p值。a、 c、d、g。误差线代表标准差*p<0.05**p<0.01***p<0.0005****p<0.0001;ns=不显著。
图2——补充图3。
图2-补充图3:shRNA介导的磷酸酶敲除对表皮重建的影响。
()感染和选择后一周,慢病毒介导的shRNA击倒18s RNA后,RT-qPCR定量磷酸酶mRNA水平。p值由单向方差分析产生。(b)敲除DUSP6、PPTC7、PTPN1、PPP3CA或PTPN13后的表皮重建。n个=2例独立感染。具有代表性的H和E图像。(c(c))如图2补充图4所示,在每个生物复制品的八个非连续切片中量化表皮厚度,并将其归一化为shSCR值。p值由单向方差分析产生。(d日)表达shSCR或sh1DUSP6的角质形成细胞重建表皮的代表性图像,TP63(黄色)和Ki67(粉红色)与DAPI核复染(蓝色)共染。白色星号表示TP63+Ki67电池。(e(电子))%Ki67标记的细胞核也是TP63+,在n个=每个复制5个字段。单因素方差分析得出的p值大于0.05。((f))角质形成细胞表达shSCR或sh1DUSP6重建表皮的代表性图像,TP63(黄色)和IVL(粉红色)共染,DAPI核复染(蓝色)。白色星号显示IVL和TP63共同染色的基底上细胞。a、 c,e。误差条表示s.d.*p<0.05**p<0.01***p<0.0005****p<0.0001;ns=无显著性。
图2——图补充4。
图2-图补充4。表皮厚度自动量化的工作流程。
草图表示从组织切片中提取表皮厚度的自动路径。python脚本分为三个步骤。(1) 通过处理“.ndpi”文件检测组织切片。通过强度聚类,背景被抑制,组织切片被定位在幻灯片上。每个部分都以最高的分辨率提取,并分成四个小插曲。(2) 利用每个渐晕图中H和E染色的信息分离表皮。应用自动阈值法仅选择表皮。通过对每个物体的大小设置阈值,可以抑制尺寸较小的潜在人工制品。(3) 通过像素计数测量表皮面积。为了测量表皮厚度,该区域被一个1像素宽的缩小图像分割。
图3。
图3:前承诺磷酸酶调节MAPK信号传导和AP1转录因子。
()4小时脱磷酸排序肽的基因本体(GO)术语富集分析(b)维恩图显示了在4小时内调节的信号通路的交叉点(c(c))4小时时前15个去磷酸化肽位点,显示磷酸肽变化和总蛋白变化之间的比率。以橙色突出显示的是MAPK上的磷酸化。(d、 e(电子))代表性western blot(d日)和量化(e(电子))在悬浮液中0、4、8和12小时后采集的细胞中显示磷酸化ERK1/2和总ERK1/2。亲环素B:负荷控制。((f))Heatmap表示悬浮诱导分化后磷酸酶敲除期间AP1转录因子超家族成员的mRNA表达(相对于18s RNA)(n个 = 3; 绘制的值是三个独立转染的平均值)。有关双向方差分析生成的p值,请参阅补充文件6。(克–小时)DUSP10敲除后悬浮细胞中磷酸化ERK1/2和总ERK1/2的代表性蛋白质印迹(定量)。显示了siSCR和加载控制。()热图显示了DUSP6和DUSP10基因敲除后JUN、FOS和MAF家族成员的mRNA表达(相对于18 s mRNA)(绘制的值是针对扰乱对照标准化的三个独立转染的平均值;双向方差分析生成的p值见补充文件7)。(j个)多西环素诱导DUSP10、DUSP6和突变体DUSP6过度表达后的克隆生长(代表性培养皿和定量)C293S系列在原代角质形成细胞中(n个=3种独立文化)。使用单因素方差分析和Dunn多重比较检验计算p值(*p<0.05;ns=不显著)。
图3——图补充1。
图3-图补充1。DUSP10敲除以及DUSP6和DUSP10过度表达的影响。
(a、 b条)蛋白质印迹()和RT-qPCR测量(b)通过SMART池siRNA击倒DUSP10。第页-值由单尾生成t吨-测试。(c、 d日)DUSP10敲除后悬浮细胞中磷酸化p38和总p38的蛋白质印迹。显示了siSCR、亲环蛋白B负载控制和定量。(e(电子))RT-qPCR定量研究强力霉素诱导DUSP6、突变型DUSP6过度表达C293S系列与18 s mRNA相关的DUSP10。用1µg/ml多西环素处理细胞24小时。通过单尾产生p值t吨-测试。((f))RT-qPCR定量分析Cumate诱导的DUSP6和突变型DUSP6过度表达C293S系列通过单因素方差分析得出p值。()展示过表达野生型和突变型DUSP6对克隆生长的影响的代表性培养皿(代表性的n个=3盘)。(b、 e、f)误差线代表标准差*p<0.05***p<0.0005****p<0.0001;ns=不显著。
图4。
图4磷酸酶的自动调节网络控制承诺。
()颜色表示相对于0小时磷酸酶mRNA表达的对数2倍变化(绘制的值是针对siSCR对照标准化的三个独立实验的平均值)。(b)编码为布尔网络轨迹约束的实验观测。我们定义了三个实验限制(在没有药物抑制剂的情况下,以及在TSA和PKCi治疗下,悬浮诱导分化期间的基因表达变化)。每个约束在指定的时间步长编码离散的基因表达状态。对于没有药物的细胞,我们实施了一种切换方案,系统必须改变代表性网络,以实现表达约束。黄色方框表示表示该步骤中系统的网络;给定步骤(列)的空白框表示我们没有强加特定的网络,因此系统可以保留在当前网络中或向前切换。活动意味着该基因在该步骤中被视为“开启”,非活动意味着在该步骤“关闭”。离散化在补充文件9中提供。(c(c))能够满足布尔形式主义模型约束的网络(b)如图所示。实线显示已在中计算的交互作用(),而虚线是根据图4补充图1推断出的可能相互作用。另见补充文件8和9。(d日)热图表示用PKCi或TSA在悬浮液中处理12小时的细胞中单个磷酸酶的mRNA表达(相对于18s mRNA)(绘制的值是针对载体处理的对照标准化的三个独立实验的平均值)。(e、 (f))承诺表示为x方向上的两个鞍节点分支控制细胞或经PKCi或TSA处理的细胞的状态空间。在对照组中,干细胞和分化细胞的状态都是稳定的(吸引子),而承诺是不稳定的状态。由于0小时网络能够在12小时达到PKCi的表达限制,我们假设在PKCi治疗中,唯一的稳定状态是干态。在TSA治疗中,必须从0小时网络切换,但在任何时间点都无法到达12小时网络;因此,我们假设承诺成为一种稳定状态,而干细胞和分化细胞状态是不稳定的。()用针对承诺磷酸酶或ITGβ1的抗体标记并用DAPI复染(蓝色)的整个人类表皮的3D体积绘制的共聚焦图像。图中还显示了每种磷酸酶相对于ITGβ1的分布。(小时)在PDMS地形底物上培养并用DUSP10和DUSP6抗体标记的原代角质形成细胞的三维体积共焦图像。比例尺:100μm。
图4——图补充1。
图4补充了1.模拟布尔网络。
()六种承诺磷酸酶之间所有可能相互作用的单个ABN。(b)回复:图4a中相同网络的SIN表示。(c(c))回复:网络的SIN表示b)(实线)和其他可能的相互作用(虚线),从图4中推断,图补充2d,e。
图4——图补充2。
图4补充图2。敲除和TSA或PKCi治疗对磷酸酶表达的影响。
()热图显示随着悬浮时间(0、4、8、12小时),击倒单个磷酸酶对其他磷酸酶mRNA水平的影响。RT-qPCR与18s mRNA相关(n个=3个独立转染;参见补充文件9,了解使用Dunnett多重比较测试的双向方差分析生成的p值)。(b)TSA和PKCi对在甲基纤维素中悬浮12小时后恢复的角质形成细胞克隆原性的影响。n=3的典型培养皿。(c(c))细胞悬浮12小时后IVL、TGM、ITGα6和TP63的mRNA水平。用TSA、PKCi或DMSO(载体对照)处理细胞(n个=3个独立处理的培养物,每个培养物有两个技术复制品)。比较的p值由单向方差分析生成。(d日)Western印迹显示敲低扰乱对照(siSCR)、DUSP6、PPTC7、PTPN1、PTPN13或PPP3CA和悬浮液0、4、8或12小时后原代角质形成细胞中的磷酸酶水平。嗜环蛋白B:负载对照。(e(电子))强力霉素诱导DUSP6、突变体DUSP6过度表达后磷酸酶mRNA水平(相对于18s mRNA)的RT-qPCR定量C293S系列和DUSP10。用1µg/ml多西环素处理细胞8、24或48小时(n个=3种独立文化;参见补充文件10,了解使用Dunnett多重比较测试的双向方差分析生成的p值)。
图4-图补充3。
图4补充图3.DUSP6和DUSP10在人表皮全层中的分布。
(a、 b条)用DUSP6抗体(红色,a;绿色,b)和ITGα6(绿色,)或DUSP10(红色,b). 全部金额用DAPI(蓝色)复染。

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引用人

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