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.2017年8月1日；36(15):2251-2262.
doi:10.15252/embj.201796905。 Epub 2017年6月30日。

Spy1/RINGO蛋白对不同细胞周期蛋白依赖性激酶激活的结构基础

丹尼斯·麦格拉思 1, 布雷安·菲菲尔德 2, 艾美·H·马尔索 1, 萨文德·特里帕蒂 1, 丽莎·波特 2, 赛斯·M·鲁宾 三
附属公司

Spy1/RINGO蛋白对不同细胞周期蛋白依赖性激酶激活的结构基础

丹尼斯·麦格拉思等。 欧洲工商管理硕士J. .

摘要

细胞周期素依赖性激酶（Cdk）是细胞分裂的主要驱动因素，是抑制异常增殖的重要治疗靶点。Cdk酶活性通过细胞周期蛋白相互作用、翻译后修饰和抑制剂（如p27抑癌蛋白）的结合紧密控制。Spy1/RINGO（Spy1）蛋白结合并激活Cdk，但对建立细胞周期检查点的经典调节机制具有抗性。癌细胞利用Spy1通过不适当激活Cdk来刺激增殖，但其机制尚不清楚。我们测定了Cdk2-Spy1和p27-Cdk2-Spy1配合物的晶体结构，揭示了Spy1如何激活Cdk。我们发现，Spy1使Cdk2发生结构改变，从而消除了Cdk活化环磷酸化的需要。Spy1缺乏调节p27和底物亲和力的细胞周期蛋白结合位点，这解释了为什么Cdk-Spy1被p27抑制得很差，并且对具有细胞周期蛋白对接位点的底物缺乏特异性。我们发现Spy1中的突变破坏了其激活Cdk2和增殖细胞的能力。我们对Spy1的结构描述提供了重要的机制见解，可用于靶向癌症中上调的Spy1。

关键词：Cdk；细胞周期；激酶抑制剂；第27页；蛋白质磷酸化。

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数字

图EV1
图EV1。Spy1与其他细胞周期蛋白样蛋白的序列比较
指出了Spy1细胞周期蛋白盒褶皱（CBF）和细胞周期蛋白A CBF中的二级结构元素。表中显示了每个序列和Spy1A之间的总体成对%序列标识。使用Clustal W对序列进行比对。
图1
图1。Spy1结合诱导活性Cdk2构象

  1. Cdk2‐Spy1（S/R箱）综合体的总体结构。

  2. Cdk2单独与CycA或Spy1复合物中Cdk1激酶结构域结构的比较。Spy1络合物中的PSTAIRE螺旋（E51指向活性位点）和T‐loop（延伸至远离活性位点）的构象与活性CycA络合物中它们的构象相似。

  3. CycA和Spy1与Cdk2结合的比较，Cdk2通过两种复合结构中激酶结构域的比对产生。间谍有一个单一的周期蛋白盒折叠，与PSTAIRE螺旋接触的螺旋与CycA中的类似螺旋具有相似的位置和方向。

  4. S/R盒域内Spy1同源物的序列比对。图中显示了Cdk2‐Spy1A结构的二级结构，虚线对应于没有可见电子密度的序列。指示Spy1中接触Cdk2 PSTAIRE螺旋（红色方块）和T‐loop（红色圆圈）的残留物。

图2
图2。Spy1与Cdk2的相互作用PSTAIRE公司螺旋线

  1. Spy1‐PSTAIRE界面的特写视图。

  2. Spy1和CycA之间PSTAIRE螺旋相互作用的比较。

图3
图3。Cdk2‐Spy1活性对Cdk2T‐loop磷酸化不敏感

  1. 所示Cdk2络合物中T环构象的比较。Spy1诱导的T环结构与磷酸化Cdk2中的活性构象更为相似。T回路T160的位置如各结构所示。

  2. 通过指示的激酶复合物在10分钟内与32P‐ATP。车道对应于1、2、4、8、12和20μM FoxM1。使用Cdk2-CycA和Cdk2-Spy1 S/R盒进行分析。

  3. 初始激酶反应速率由实验中的条带定量确定，如（B）所示。报告值是三个不同实验的平均值，标准偏差显示为误差线。表中显示了三次重复的平均动力学参数（标准偏差报告为误差）。

可在线获取此图的源数据。
图EV2
图EV2。使用视网膜母细胞瘤（Rb）蛋白C末端结构域的Cdk2‐Spy1激酶反应
激酶分析如图3所示，Rb除外771–875，包含7个Cdk共有位点作为底物。报告值是三个不同实验的平均值，标准偏差显示为误差线。表中显示了三个重复试验的平均动力学参数（标准偏差报告为误差）。可在线获取此图的源数据。
图4
图4。Spy1使用几个保守的酸性侧链来协调Cdk2 T‐loop

  1. Spy1接口与Cdk2 T‐loop的特写视图。

  2. 如图3B所示，全长Spy1（Spy1 DE）中D97和E135的突变会消除激酶活性。

  3. 用空载体对照（载体）、Spy1野生型（Spy1）或Spy1‐DE（Spy1-DE）瞬时转染HEK‐293和NIH 3T3细胞，并使用RT-qPCR确认转染和监测表达水平（下图）。台盼蓝排除分析用于评估5天后的增殖情况（上图）。误差条代表标准误差(n个 = 3); 学生的t吨‐测试*P（P） < 0.05.

可在线获取此图的源数据。
图5
图5。Spy1缺乏Cdk抑制剂和底物的结合间隙

  1. 通过Cdk2‐Spy1和Cdk2‐CycA‐p27结构中Cdk2激酶结构域的比对产生的CycA和Spy1的比较。Spy1缺少CycA中存在的MRAIL结合间隙，p27插入其中。

  2. p27能有效抑制Cdk2‐CycA，但不能抑制Cdk‐Spy1。如图3所示，用4μM FoxM1底物和全长Spy1进行激酶分析。每个反应中p27的浓度从左到右分别为0、75、150、300、600、1200和2400 nM。报告值是三个不同实验的平均值，标准偏差显示为误差线。

  3. p27的晶体结构儿童‐Cdk2‐CycA三元络合物。

可在线获取此图的源数据。
图EV3
图EV3。p27激酶抑制域的等温滴定量热法测定(儿童)绑定到Cdk2‐Spy1（S/R盒）
图6
图6。与Cdk2-CycA相比，Cdk2‐Spy1对基底对接位点的存在不太敏感
激酶分析如图3所示，但使用全长Spy1和Rb C末端结构域（RbC，7个共有Cdk位点）作为底物。F877A包含RxLF序列中的一个突变，该突变与CycA中的MRAIL位点对接。报告值是三个不同实验的平均值，标准偏差显示为误差线。表中显示了三个重复试验的平均动力学参数（标准偏差报告为误差）。可在线获取此图的源数据。
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