跳到主页内容
美国国旗

美国政府的官方网站

Dot政府

gov意味着它是官方的。
联邦政府网站通常以.gov或.mil结尾。之前分享敏感信息，确保你在联邦政府政府网站。

Https系统

该站点是安全的。
这个https（https）：//确保您连接到官方网站，并且您提供的任何信息都是加密的并安全传输。

访问密钥 NCBI主页 MyNCBI主页 主要内容 主导航
.2017年6月20日；114(25):6545-6550.
doi:10.1073/pnas.1617286114。 Epub 2017年6月2日。

微管蛋白酪氨酸连接酶样3的晶体结构揭示了微管蛋白单糖化酶特有的基本结构元素

克里斯托弗·加纳姆 1, 伊恩·余（Ian Yu） 1, 阎丽 2, 安东妮娜月饼 3 4
附属公司

微管蛋白酪氨酸连接酶样3的晶体结构揭示了微管蛋白单糖化酶特有的基本结构元素

克里斯托弗·加纳姆等。 美国国家科学院程序. .

摘要

糖基化和谷氨酰化是指在固有无序的微管蛋白C末端尾部中，将甘氨酸和谷氨酸盐翻译后添加到基因编码的谷胱甘肽，对纤毛和鞭毛的生物发生和稳定性至关重要，在后生动物的发育中起着重要作用。微管蛋白酪氨酸连接酶类（TTLL）酶的不同家族成员对这些修饰进行催化，这些修饰是进化上保守的复杂微管蛋白编码的一部分，调节微管与细胞效应器的相互作用。TTLL酶的位点特异性及其生物化学相互作用在很大程度上仍然未知。在这里，我们报道了微管蛋白糖基化酶的体外特性。我们表明，TTLL3在四个位点上以层级顺序将β-微管蛋白尾部糖基化，并且TTLL3和谷氨酰化酶TTLL7竞争微管蛋白尾巴上的重叠位点，为轴突中观察到的谷胱甘肽化和糖基化之间的反相关提供了分子基础。这种反相关性表明，以两种不同翻译后修饰形式编写的组合微管蛋白代码如何通过相关但不同的TTLL酶的活性产生。为了阐明是什么结构元件将TTLL甘氨酰化酶与谷胱甘肽酶区分开来，它们共享共同的TTL支架，我们测定了分辨率为2.3？的TTLL3 X射线结构。这种结构揭示了甘氨酰initiases特有的两种结构元素，对其活性至关重要。因此，我们的工作揭示了TTLL酶的结构和功能多样化，并为理解微管蛋白代码是如何通过多种TTLL酶活性的交叉而编写的迈出了重要的一步。

关键词：TTLL酶；谷氨酰化；糖基化；微管蛋白编码；微管蛋白修饰。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

数字

图1。
图1。
TTLL3是一种修饰β-微管蛋白尾部的糖基化启动酶。(A类)合成C末端α1B-的反褶积质谱(左侧)和βI-微管蛋白肽(赖特)TTLL3以1:20酶：肽摩尔比进行糖基化。未修饰肽t吨0h，黑色；对应于糖基化产物的峰，α1B和βI分别为绿色和蓝色。每个物种中添加的Gly数都会显示出来。(B)TTLL3以1:20酶：微管蛋白摩尔比对紫杉醇稳定的人微管（MTs）进行糖基化的去卷积α-和β-微管蛋白质谱。添加的Gly数根据异构体进行指示和着色。***表示Na+和（N2氢氧化铁）1+LC/MS期间生成的加合物（46）。(C类)TTLL3修饰人幼稚微管的反相LC/MS追踪正常化米/z单个βI-微管蛋白糖基化物随时间变化的强度(SI材料和方法). 平均值±SEM(n个= 3). (D类)MS/MS实验中βI-微管蛋白尾部TTLL3糖基化的层次结构(材料和方法).
图S1。
图S1。
通过反相LC/MS监测微管和合成βI-微管肽底物的TTLL3糖基化时间进程(A类)经TTLL3以1:10比例修饰并通过反相LC/MS分离的紫杉醇稳定的人源性微管的色谱图（220 nm）。注意，所有β-微管蛋白亚型在反相分离过程中共稀释。mAu，吸光度单位。(B)显示时间过程中每种物种原始强度的非卷积LC/MS光谱(t吨=0、0.5、1、2、4、8、12、18和24小时）。每个时间点显示了两个代表性光谱（蓝色和红色）。只有βI-微管蛋白物种被标记，因为在反应过程中只跟踪其强度。(C类)以1:10比例修饰的TTLL3糖基化合成βI-微管蛋白尾部肽的反相LC/MS分析米/z单个糖基化βI-微管蛋白肽的强度随时间变化(SI材料和方法). 数值为平均值±SEM(n个=4）。(D类)非卷积LC/MS光谱显示了时间过程中每种肽的原始强度(t吨=0、0.75、1.5、3、6、9、17.5和24小时）。每个时间点显示了两个具有代表性的光谱。
图S2。
图S2。
通过TTLL3糖基化微管蛋白水解释放的微管蛋白C末端尾部的MS/MS测序。天冬氨酸-N释放的C末端幼稚人微管尾部糖基化的MS/MS测序十、热带TTLL3(A类)单糖基化物种。(B)二糖基化物种。(C类)三糖基化物。(D类)四糖基化物种。每个光谱中的单个a-、b-和y-系列离子以及推导出的氨基酸序列都被指出。星号表示中性损失H的离子2O组。列出了质量不允许明确推导氨基酸序列的离子的所有可能种类。两种三酰化物，DFG电气工程师A类E类EEA和DFGE类每个电气工程师EA（糖基化位点用粗体表示），在反相分离过程中共稀释，无法分离成单独的光谱。为了清楚起见，我们将y和b离子旁边添加的Gly数列为+n个Gly，其中n个是特定离子物种上的甘氨酸数量。(E类)Asp-N释放的单甘氨酰化尾肽的提取离子色谱图，主要显示E441修饰的单一物种。(F类)天冬氨酸-N释放的二酰化尾肽XIC，显示两种不同的物种，在E438/E441或E441/E442处修饰。(G公司)天冬氨酸-N释放的四糖基化尾肽XIC，显示两种不同的物种，在E438/E441/E442/E443或E438/E439/E441/E442处修饰（参见材料和方法更多详细信息）。
图2。
图2。
TTLL3和TTLL7竞争β-微管蛋白尾部的重叠位点。(A类)βI-微管蛋白尾部肽片段的质谱（MS/MS）图谱，该片段由TTLL7谷氨酰胺化的微管蛋白水解释放，显示E441处的谷氨酰胺化。每个光谱中的单个a-、b-和y-系列离子与推导的序列一起显示。星号表示中性损失H的离子2O组。注释i:j表示来自内部解理的片段；例如，b4:7代表从第四个残基到第七个残基的肽片段。当不同碎片具有相同质量时，列出了所有可能的物种(B)βI-微管蛋白尾部肽片段的MS/MS谱，该片段是由TTLL3糖基化的微管蛋白水解释放的，在E441处显示糖基化（注释为A类). (C类)未经修饰和异质性脑微管上TTLL3的标准化糖基化活性。平均值±SEM(n个= 3). (D类)未修饰和戊二酰化微管上TTLL3的归一化TTLL3糖基化活性。平均值±SEM(n个= 2). 显示了添加到α-和β-微管蛋白中的谷氨酸盐的加权平均值。(D类,插入)用单糖基化特异性TAP952抗体探测每个反应的3h时间点的Western blot(顶部)谷胱甘肽化微管作为底物的考马斯染色SDS/PAGE(底部).
图S3。
图S3。
TTLL7谷氨酰胺化微管蛋白水解释放的微管蛋白C末端尾部的MS/MS测序。(A类)TTLL7修饰的紫杉醇稳定人体微管的反相LC/MS分析。以1:10酶：微管蛋白摩尔比与TTLL7孵育0和1小时后的解卷曲α-和β-微管蛋白质谱。添加的谷胱甘肽的加权平均值根据亚型显示并着色。(B和C类)谷氨酰胺化天冬氨酸-N释放微管尾部的MS/MS测序十、热带TTLL7.指出了每个光谱的单个a-、b-和y-系列离子，以及推导的氨基酸序列。星号表示中性损失H的离子2O组。当不同的碎片具有相同的质量时，会列出所有可能的物种。
图3。
图3。
TTLL3晶体结构和整个TTLL家族的比较。(A类)绑定到AMPPNP的TTLL3核心的卡通表示。(B)IS2α7和中心结构域α5之间的界面特写。(C类)特写显示IS1α1和α3之间的相互作用。(D类)TTL的X射线晶体结构[蛋白质数据库（PDB）ID代码4IHJ]。(E类)TTLL7的混合X射线和低温电子显微镜结构[PDB ID代码4YLS，电子显微镜数据库（EMD）ID代码EMD-6307]；cMTBD原子模型（gold）基于EM图，是不完整的。核苷酸是球状和棒状的。球体表示无序的线段。
图S4。
图S4。
TTLL3的X射线晶体结构。(A类)单波长反常色散相位和密度修正后1σ处电子密度截面的立体图。所示为的一部分十、热带TTLL3以螺旋α11为中心。显示了可归因于EMP修饰Cys150的额外电子密度。(B)TTLL3的不对称单位二聚体。(C类)凝胶渗透色谱十、热带TTLL3（残基6–569，E520Q）。在Superdex 75柱（10/300）上，在20 mM Hepes（pH 7）、200 mM KCl、10 mM MgCl中分离出约3 mg蛋白质2和2 mM TCEP。(C类,插入)相同缓冲条件下的蛋白质标准。V（V）o（o），孔隙体积；V（V）t吨，总柱体积。(D类)TTLL3残基6–569、6–592和1–830的标准化体外糖基化活性。从HEK293细胞中纯化出1–830结构。误差条代表SEM(n个= 3). (E类)不对称单元中两个TTLL3副本的对齐。(F类)TTLL3活动站点的特写视图，显示Fo（o）−英尺c（c）（灰色网格；σ2.5）和2Fo（o）−英尺c（c）在建模核苷酸之前，省略map电子密度（橙色网格；σ2.5）。γ-磷酸盐未解析的AMPPNP以球和棒的形式显示。
图S5。
图S5。
TTLL3和TTLL8序列的比对。二级结构元素显示在相应序列的上方。α-螺旋，圆柱体；β-股，箭头；随机线圈、线。由于电子密度分辨率低而未构建的TTLL3段用虚线表示。序列标识使用从白色（低于40%）到红色（100%）的渐变进行彩色编码。参与核苷酸结合的残基用星号表示；对活性至关重要的残基用红色X表示。红色箭头表示通过MS/MS测序确定的TTLL3中的自糖基化位点。参与形成π螺旋的残基用∏表示。与结肠癌（23、41）相关的TTLL3突变在其各自位置上方以红色表示；人类延伸甘氨酸酶TTLL10的失活突变（12）呈灰色。
图4。
图4。
TTLL3微管糖基化的分子决定因素。(A类)TTLL3分子表面根据保守性着色（红色，100%同一性；白色，<40%）。(B)根据静电势着色的TTLL3分子表面（红色，负；蓝色，正；从−7到+7k个BT） ●●●●。IS2残基D265–D267在我们的结构中未被分解。(C类)TTLL3结构显示残基对糖基化很重要。拟定微管结合界面处的残留物以水表示；活性位点和微管蛋白尾结合沟中的蛋白以橙色显示。IS1和IS2分别为红色和紫色。无序区域显示为球体。(D类)重组结构导向的TTLL3突变体与未修饰人微管的正常化体外糖基化活性。使用TAP952抗单甘基化微管蛋白抗体通过蛋白质印迹测量活性(SI材料和方法). *P（P）< 0.05, **P（P）<0.01，以及****P（P）<0.0001。平均值±SEM(n个≥6）。
图S6。
图S6。
TTLL3表面根据守恒和静电势着色。(A类)TTLL3的表面表示（与图4中的视图相比旋转了90°A类)根据TTLL3亚型之间的保守性着色（红色，100%保守性；白色，<40%）。箭头表示残基对糖基化很重要。(B)TTLL3分子表面（与图4中的视图相比旋转了90°B)根据静电势进行彩色编码（红色，负极；蓝色，正极；从−7到+7k个BT） ●●●●。
图5。
图5。
TTLL3和TTLL8共享对糖基化至关重要的结构元素。(A类)如图4所示，根据TTLL3和TTLL8s之间的守恒，对TTLL3分子表面着色A类箭头表示TTLL8残基对糖基化很重要。残基D328–D330在我们的结构中未被分解(SI材料和方法); 它们的大致位置用箭头表示。(B)通过定量U2OS细胞免疫荧光的糖基化信号测定GFP标记野生型小鼠TTLL8和定点突变体的正常糖基化活性(SI材料和方法;n个每个构造≥50个细胞；误差条显示SEM***P（P）< 0.001; ****P（P）< 0.0001). (C类)TTLL3和TTLL8的序列比对显示IS2 DID基序的保守性。厘米，綠蠵龜；博士，达尼奥雷里奥；Hs、，智人；嗯，小家鼠；理科，南非亚种；X吨，十、热带. (D类)瞬时转染U2OS细胞的GFP标记野生型和IS2突变体的细胞分布（绿色）和糖基化活性（红色）。（比例尺，10μm）(D类,插图)（放大倍率，2.5倍。）
图S7。
图S7。
TTLL糖基化酶的保护。(A类)TTLL3结构的卡通表示，根据TTLL3亚型之间的序列相似性（4）着色。从红色（100%保守）到白色（<40%）的渐变。(B)如中所示A类，但根据TTLL3和-8亚型之间的保守性着色。(C类)如中所示A类，但根据TTLL3、-8和-10之间的守恒性着色。TTLL3、-8和-10中保守的活性体残基以及对IS1和IS2结构完整性重要的残基也被指出。
图S8。
图S8。
代表性人类TTLL序列的基于结构的多序列比对：TTLL3（NP_001021100，BAG59759，NR_037162.1），TTLL8（XP_016884665.1），TTLL 10（NP_001123517.1），TTRL1（NP_03695.1），TILL6（NP_011124390.1），TTEL7（NP_078962.4）和TTL（NP_714923.1）。通过T-Coffee计划进行校准(www.ebi.ac.uk/Tools/msa/tcoffee/). 输出对齐被用作JALVIEW中的输入(www.jalview.org)并手动管理。残留物根据Blosum62矩阵着色，标识阈值设置为30%。二级结构元素显示在相应序列的上方。无序元素由阴影线表示。如图S5所示，单糖基化酶TTLL3和TTLL8特异的IS1和IS2被涂成红色。阳离子微管结合结构域（cMTBD）和对所有自主谷氨酰酶特异性的cMTBD锚定螺旋（仅显示TTLL6和TTLL7序列）分别呈橙色和水黄色，如图所示。3。对活性重要的糖基化酶特异性残基以红色方框突出显示，而对活性重要且在TTL和TTLL中普遍保守的残基以黑色方框突出显示。
请参阅PMC中的此图像和版权信息

类似文章

查看所有类似文章

引用人

查看所有“被引用”文章

工具书类

    1. Roll-Mecak A.固有无序微管蛋白尾部：微管功能的复杂调谐器？精液细胞开发生物学。2015;37:11–19.-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Verhey KJ，Gaertig J.微管蛋白代码。细胞周期。2007;6:2152–2160.-公共医学
    1. Yu I，Garnham CP，Roll-Mecak A.编写和读取微管蛋白代码。生物化学杂志。2015;290:17163–17172.-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Valenstein ML，Roll-Mecak A.微管蛋白谷氨酰化切断微管的分级控制。细胞。2016;164:911–921.-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Bieling P等人。CLIP-170通过动态识别复合EB1/微管蛋白结合位点来跟踪微管末端的生长。细胞生物学杂志。2008;183:1223–1233.-项目管理咨询公司-公共医学

出版物类型